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Nature, volumen 617, páginas 711–716 (2023)Citar este artículo

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La microscopía de fluorescencia, con su especificidad molecular, es uno de los principales métodos de caracterización utilizados en las ciencias de la vida para comprender sistemas biológicos complejos. Los enfoques de súper resolución1,2,3,4,5,6 pueden lograr una resolución en células en el rango de 15 a 20 nm, pero las interacciones entre biomoléculas individuales ocurren en escalas de longitud por debajo de 10 nm y la caracterización de la estructura intramolecular requiere una resolución de Ångström. Las implementaciones de superresolución de última generación7,8,9,10,11,12,13,14 han demostrado resoluciones espaciales de hasta 5 nm y precisiones de localización de 1 nm en determinadas condiciones in vitro. Sin embargo, tales resoluciones no se traducen directamente en experimentos en células, y la resolución de Ångström no se ha demostrado hasta la fecha. Aquí presentamos un método de codificación de barras de ADN, mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI), que mejora la resolución de la microscopía de fluorescencia hasta la escala de Ångström utilizando hardware y reactivos de microscopía de fluorescencia listos para usar. Al obtener imágenes secuenciales de subconjuntos de objetivos dispersos a resoluciones espaciales moderadas de> 15 nm, demostramos que se puede lograr una resolución de proteína única para biomoléculas en células enteras intactas. Además, resolvemos experimentalmente la distancia de la columna vertebral del ADN de bases individuales en origami de ADN con resolución Ångström. Usamos nuestro método en una demostración de prueba de principio para mapear la disposición molecular del objetivo de inmunoterapia CD20 in situ en células no tratadas y tratadas con medicamentos, lo que abre posibilidades para evaluar los mecanismos moleculares de la inmunoterapia dirigida. Estas observaciones demuestran que, al permitir la obtención de imágenes intramoleculares en condiciones ambientales en células enteras intactas, RESI cierra la brecha entre la microscopía de súper resolución y los estudios de biología estructural y, por lo tanto, brinda información clave para comprender sistemas biológicos complejos.

La precisión de localización (σSMLM) de una molécula objetivo en microscopía de localización de molécula única de campo amplio (SMLM)15 está limitada en última instancia y fundamentalmente por la cantidad de fotones (N) recolectados por evento de parpadeo: \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF es la desviación estándar de la función de dispersión de puntos (PSF) de la óptica sistema de imagen16, fig. 1a). Múltiples localizaciones del mismo objetivo (Fig. 1b, arriba) se distribuyen alrededor de la posición real debido a su precisión finita. Dos o más puntos que SMLM no puede resolver producen distribuciones superpuestas de localizaciones, lo que impide la asignación única de localizaciones a los respectivos objetivos (Fig. 1b, abajo). Sin embargo, si cada localización pudiera asignarse a un objetivo específico por color, código de barras o cualquier otra identidad molecular, podrían agruparse sin ambigüedades por objetivo2.

a, en SMLM, σSMLM de un solo tinte se escala con \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\), lo que en última instancia limita la resolución espacial alcanzable. b, los enfoques SMLM como DNA-PAINT presentan una resolución espacial de aproximadamente 10 nm (resolución aproximada como ancho completo a la mitad del máximo ≈ 2,35 σSMLM). Mientras que los objetivos separados por 20 nm (d1) se pueden resolver de forma rutinaria, los objetos separados por 2 nm (d2) no se pueden resolver porque las distribuciones resultantes de las localizaciones se superponen. c, Usando secuencias de ADN ortogonales (azul y verde) y adquisición secuencial como en Exchange-PAINT, las localizaciones de objetivos espaciados más cerca que el límite de resolución SMLM pueden asignarse sin ambigüedades para cada objetivo. d, la combinación de todas las localizaciones por objetivo (K) para cada ronda de imágenes mejora la precisión de localización de sd (σSMLM) a sem (σRESI). e, A medida que la superresolución revolucionó la microscopía de fluorescencia, RESI da como resultado otro cambio de paradigma al volver a aplicar el concepto de localización a los datos de superresolución. f, La precisión de localización en escalas RESI con \(\frac{1}{\sqrt{K}}\), y por lo tanto la mejora de la resolución en RESI es independiente de σSMLM, alcanzando la precisión de localización en la escala Ångström.

El centro de cada grupo de localizaciones se puede calcular con una precisión mucho mejor que σSMLM. En esencia, al aplicar el principio de microscopía de localización a grupos distinguibles de K localizaciones súper resueltas, la precisión aumenta desde el sd (σSMLM) hasta el sem (\(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}} }}{\raíz cuadrada{K}}\)). La recopilación de un número arbitrariamente grande de localizaciones produce un aumento arbitrario de la precisión. En particular, este aumento en la precisión se produce independientemente de la precisión lograda en las localizaciones individuales (σSMLM).

Presentamos una implementación sencilla de este concepto utilizando Exchange-PAINT17, una variante de DNA-PAINT18, para moléculas diana idénticas (Fig. 1c). DNA-PAINT utiliza la unión programable, repetitiva pero transitoria de hebras de 'generador de imágenes' marcadas con tinte a sus hebras de 'acoplamiento' complementarias en moléculas diana de interés9,18. La naturaleza transitoria de la unión conduce a un aparente "parpadeo" del objetivo, necesario para realizar SMLM. Exchange-PAINT utiliza códigos de barras de ADN ortogonales combinados con imágenes y ciclos de lavado para permitir la multiplexación secuencial de objetivos. En nuestra implementación, 'multiplexamos' una sola especie objetivo separándola en múltiples subconjuntos más dispersos. Al visualizarlos secuencialmente, se miden grupos de localizaciones suficientemente espaciados y aislados. Determinar el centro de cada grupo de localizaciones produce una mejora de la resolución (Fig. 1d). A esta implementación la llamamos mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI) y las localizaciones resultantes, localizaciones RESI.

Mediante la aplicación de RESI in silico (Métodos), demostramos una mejora de la resolución (Datos extendidos Fig. 1) sobre la superresolución similar a la mejora de las mediciones superresueltas sobre las de difracción limitada (Fig. 1e). Para la precisión de localización de DNA-PAINT que se puede obtener de forma rutinaria (aproximadamente 3 nm) y el número de localizaciones por objetivo (del orden de cientos), RESI podría lograr una precisión muy por debajo de un nanómetro, ingresando así en la escala de Ångström (Fig. 1f) según \( {\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\).

Para una prueba experimental del principio de RESI, utilizamos estructuras de origami de ADN autoensambladas para posicionar con precisión cadenas de ADN ortogonales9,19. Primero diseñamos origami de ADN con dos hebras de acoplamiento separadas 5 nm, una distancia previamente resuelta con DNA-PAINT7,9, para verificar la exactitud y precisión de RESI. Usando dos rondas de imágenes secuenciales y un procedimiento de alineación (Métodos) para realizar RESI, pudimos recapitular con precisión la distancia punto a punto de 5 nm con una precisión mejorada por un factor de \(\sqrt{{K}_{{\ rm{promedio}}}}=\sqrt{381}\approx 20\) (Datos extendidos Figs. 2 y 3).

A continuación, realizamos RESI en tres dimensiones (3D) utilizando estructuras de disco de origami de ADN 3D recientemente desarrolladas20 y medimos distancias entre hebras de acoplamiento de 2,5 ± 0,4 nm en xy y 11,3 ± 0,8 nm en z. Esto demuestra que la mejora de la resolución RESI se aplica en las tres dimensiones, superando las capacidades actuales de superresolución 3D de última generación (datos extendidos, figuras 4 y 5; para conocer los parámetros de imagen, consulte la tabla de datos extendidos 1).

Para demostrar la aplicabilidad de RESI en un contexto celular, a continuación tomamos imágenes de proteínas estructurales del complejo de poros nucleares (NPC). Como principal guardián del transporte nucleocitoplasmático, el NPC es un objetivo clave para la investigación en biología estructural21. Además, elegimos el NPC como sistema modelo porque ha sido bien estudiado utilizando una variedad de enfoques de imágenes, incluida la microscopía crioelectrónica (crio-EM)22, la microscopía de fluorescencia y las técnicas de superresolución23,24. La Figura 2a presenta una imagen típica limitada por difracción y PINTURA de ADN de moléculas Nup96 (etiquetadas con proteína fluorescente verde mejorada monomérica (mEGFP)) etiquetadas con nanocuerpos anti-GFP conjugados con ADN. Nup96 es una proteína NPC estructural (parte del llamado complejo Y) presente en ocho pares que exhiben una simetría de ocho veces en los anillos citoplasmático y nuclear, con un total de 32 copias por NPC (Fig. 2b). Los pares individuales de proteínas Nup96, espaciados aproximadamente 10 nm lateralmente y 3 nm axialmente, no se pueden resolver de forma rutinaria con las implementaciones actuales de superresolución de última generación25,26,27,28. Para habilitar RESI, las copias vecinas de las proteínas Nup96 deben etiquetarse con secuencias de ADN ortogonales. Con este fin, optamos por un enfoque de etiquetado estocástico al incubar la muestra con nanocuerpos anti-GFP, cada uno conjugado con una de las cuatro secuencias ortogonales (Fig. 2c). Observamos que, con un número creciente de objetivos esperados por debajo del límite de resolución clásico de DNA-PAINT, se necesita un mayor número de secuencias de etiquetado ortogonales29 y, por lo tanto, rondas de imágenes, para garantizar grupos de localizaciones suficientemente espaciados (para obtener detalles sobre este requisito, consulte Métodos ). La adquisición secuencial de imágenes 3D en cuatro rondas condujo a grupos de localización suficientemente espaciados que representan moléculas diana únicas de Nup96 (Fig. 2d). La superlocalización posterior de RESI de estos grupos nos permitió visualizar de forma rutinaria copias individuales de proteínas Nup96 (Fig. 2e). Notamos que esto se logró en todo el campo de visión (aproximadamente 67 × 67 µm2) con un total de más de 1,000 NPC durante un tiempo total de adquisición de imágenes de 100 min (ver Datos extendidos Fig. 6 para datos representativos). La imagen RESI reconstruida presenta una precisión de localización lateral promedio de aproximadamente 1 nm, lo que representa una mejora de seis veces con respecto a las rondas de adquisición de DNA-PAINT individuales. Por lo tanto, logramos una resolución limitada por tamaño de etiqueta, lo que nos permitió resolver moléculas Nup96 individuales (Fig. 2f). En general, el tamaño de la etiqueta no solo limita la resolución espacial, sino que además podría dar lugar a imprecisiones, como distancias observadas sesgadas debido a errores de vinculación.

a, imagen general limitada por difracción y DNA-PAINT de Nup96-mEGFP marcado con nanocuerpos anti-GFP conjugados con ADN. La vista ampliada (abajo a la derecha) muestra una alta eficiencia de etiquetado y calidad de imagen para condiciones estándar de DNA-PAINT, recapitulando la simetría de ocho veces del NPC. b, representación de la estructura Cryo-EM de la ubicación de las proteínas Nup96 (rojo; posición de mEGFP C-terminal marcada en azul) como parte del complejo Y en anillos nucleares y citoplasmáticos (NR y CR, respectivamente). Adaptado de PDB 7PEQ. Nup96 está presente en 32 copias por NPC. c, Para habilitar RESI, las proteínas Nup96-mEGFP se marcaron estocásticamente con secuencias de ADN ortogonales mediante la incubación de la muestra con nanocuerpos anti-GFP, cada uno conjugado con una de cuatro secuencias ortogonales (representadas por puntos azules, amarillos, magenta y verdes). d, las imágenes 3D secuenciales (el color representa la posición z) de las cuatro etiquetas produjeron distribuciones de localización suficientemente espaciadas. El número promedio de localizaciones por objetivo es Kapromedio = 38 (el fondo representa la estructura crio-EM de b para el contexto). e, Comparación de 3D DNA-PAINT (arriba a la izquierda) y 3D RESI (abajo a la derecha) para el mismo NPC que ilustra la mejora en la resolución espacial por RESI. Las localizaciones se representan como gaussianas con σDNA-PAINT y σRESI, respectivamente. f, Se logró una precisión de localización (σRESI) tan buena como 5 Å mediante la combinación de localizaciones K para cada objetivo, resolviendo sin ambigüedades las proteínas Nup96 individuales. g, La estructura 3D NPC crio-EM se recapituló mediante microscopía óptica mediante la aplicación de un promedio sin modelo30 de 1217 NPC de un solo núcleo. h, RESI resolvió Nup96 adyacente en un promedio estructural por microscopía óptica. i, de acuerdo con la estructura crio-EM (teniendo en cuenta el error de enlace que surge del tamaño de la etiqueta), las proteínas Nup96 adyacentes estaban separadas 11,9 ± 1,2 nm lateralmente (arriba) y 5,4 ± 0,4 nm axialmente (abajo).

Luego realizamos un promedio 3D imparcial de 1217 NPC utilizando un enfoque sin modelo desarrollado recientemente para datos SMLM30. El promedio 3D resultante (Fig. 2g) no solo permite la recapitulación de la simetría de ocho veces de Nup96 tanto en anillos citoplasmáticos como nucleares (lo que se logró previamente con superresolución23,24,25,26,27,28), pero permite la resolución de proteínas Nup96 individuales en un promedio estructural (Fig. 2h). Gracias a la resolución espacial sin precedentes de RESI, pudimos recapitular distancias de proteínas Nup96 de 11,9 ± 1,2 nm lateralmente y 5,4 ± 0,4 nm axialmente desde la imagen estructural promedio (Fig. 2i). Tanto la orientación lateral y axial, así como la inclinación, de los pares de Nup96 son consistentes con los datos crio-EM22. Resolvimos esta disposición espacial para la mayoría de los pares de proteínas Nup96 (Datos extendidos Fig. 7), que anteriormente estaba fuera del alcance de la microscopía óptica.

Para analizar la resolución espacial alcanzable en última instancia por RESI, diseñamos una estructura de origami de ADN plana y rectangular con seis pares (espaciados a 20 nm de distancia) de hebras de acoplamiento ortogonales directamente adyacentes a una distancia de solo un par de bases de ADN (hebras rojas y azules en la Fig. 3a). Esto produjo una distancia diseñada en el plano de alrededor de 7 Å a lo largo de la columna vertebral de una hebra de la doble hélice de ADN31. Las estructuras también contienen hebras de acoplamiento de DNA-PAINT para una alineación precisa entre rondas de imágenes secuenciales (hebras verdes en la Fig. 3a). La adquisición de imágenes DNA-PAINT de última generación32 con una resolución espacial de aproximadamente 5 nm arrojó seis nubes de localización en una disposición de cuadrícula de 20 nm, pero no logró resolver las hebras de acoplamiento individuales a distancias subnanométricas de un solo par de bases (Fig. 3b).

a, origami de ADN con hebras de acoplamiento separadas por un solo par de bases (pb; hebras rojas y azules, con marcadores de alineación en verde) proporcionaron una plataforma para demostrar la resolución más alta alcanzable por RESI. b, DNA-PAINT resolvió el espaciado de 20 nm, pero la resolución fue insuficiente para distinguir los sitios de acoplamiento individuales, separados por una base. c, RESI resuelve los hilos de acoplamiento adyacentes. d, se calculó una distancia euclidiana de 8,5 ± 1,7 Å a partir de localizaciones individuales con una precisión promedio de 1,2 Å (izquierda) para la distancia de la columna vertebral de un solo par de bases, que está dentro de 1 sd del valor esperado de aproximadamente 7 Å (derecha ). e, la precisión de localización experimental en RESI está en buen acuerdo con \(\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K}}\) (línea azul, K), lo que produce un precisión de localización promedio de 1.3 Å para los datos experimentales de todos los origami de ADN n = 42 (los recuadros corresponden al par de puntos ejemplar en d). Las barras de error representan la media ± 1 sd

Sorprendentemente, RESI resuelve las posiciones individuales de la cadena de acoplamiento (Fig. 3c) en todas las estructuras de origami de ADN. Observamos que RESI logró esto en un tiempo de adquisición de imágenes de 100 min con un campo de visión de aproximadamente 67 × 67 μm2 que contiene más de 2000 estructuras de origami de ADN (consulte Datos extendidos en la Fig. 8 para ver estructuras de origami de ADN representativas). RESI nos permite resolver rutinariamente hebras separadas por solo un par de bases de ADN. Sorprendentemente, medimos una distancia de 8,5 ± 1,7 Å entre dos hebras de acoplamiento individuales en una estructura de origami de ADN individual (Fig. 3d). Esto demuestra una resolución sin precedentes en microscopía óptica al distinguir estructuras a menos de un nanómetro. Observamos que nuestro reclamo de resolución se basa en la definición más fundamental y estricta: la capacidad de distinguir objetos puntuales espacialmente. Medimos una distancia de 9,5 ± 2,6 Å entre hebras de acoplamiento adyacentes en un promedio de 42 origami de ADN (datos extendidos Fig. 9), que está dentro de 1 sd de la distancia esperada de la columna vertebral31 de alrededor de 7 Å.

Para cuantificar la ganancia de resolución, calculamos las localizaciones RESI para diferentes valores de K localizaciones subyacentes de DNA-PAINT (Métodos). Demostramos que la precisión de localización efectiva escala como \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K} }\), lo que arroja una precisión de localización promedio de 1.3 Å para un K promedio = 254 (Fig. 3e), lo que confirma experimentalmente los resultados in silico (Fig. 1f). RESI no solo produce un número prácticamente ilimitado de localizaciones por objetivo, sino que también evita los efectos fotofísicos perjudiciales causados ​​por la proximidad espacial de las etiquetas de tinte fijo porque, en las imágenes de DNA-PAINT, dos tintes adyacentes nunca están presentes simultáneamente. Recientemente se informó33 que, a distancias inferiores a 10 nm, las interacciones fotofísicas de campo cercano desempeñan un papel importante en la modulación de la cinética de fotoconmutación, lo que evita que las técnicas SMLM de colorante fijo accedan a esta escala de resolución. En última instancia, esto limita la resolución alcanzable de incluso las técnicas más eficientes en fotones disponibles para la localización de moléculas individuales, como MINFLUX o MINSTED, a pesar de su precisión subnanométrica, a menos que se combinen con DNA-PAINT. La resolución subnanométrica demostrada experimentalmente ilustra la capacidad de RESI para permitir estudios de biología estructural utilizando imágenes basadas en ADN en escalas hasta ahora difíciles de alcanzar.

Finalmente, aplicamos RESI para abordar y resolver una cuestión de biología celular actualmente en debate que hasta ahora ha estado fuera del alcance tanto de la crio-EM en un contexto celular nativo como de las técnicas de superresolución establecidas. Específicamente, estudiamos la organización de los receptores de membrana CD20, que son objetivos principales para el tratamiento con anticuerpos terapéuticos de los cánceres de sangre derivados de células B y las enfermedades autoinmunes34.

En el caso del anticuerpo anti-CD20 terapéutico más utilizado, el rituximab (RTX), se cree que la reorganización espacial de CD20 en la membrana celular juega un papel importante en su eficacia35,36. Recientes estudios crio-EM detectaron CD20 como un dímero en complejo con dos regiones individuales de unión al antígeno del fragmento RTX37,38, lo que sugiere un ensamblaje similar a una cadena lineal de CD20 en presencia del anticuerpo completo38. Por otro lado, cuando se incubó con el anticuerpo RTX completo, se detectó un anillo trimérico de moléculas RTX alternas y dímeros CD20 en imágenes EM37. El hecho de que los experimentos de crio-EM se realicen en una solución de detergente plantea la cuestión de qué arreglos moleculares están realmente presentes en la célula. Actualmente, no se puede evaluar la organización de CD20 cuando se une a anticuerpos RTX completos en células intactas, lo que impide la investigación de si los grupos de CD20 son de naturaleza lineal o circular. Además, aunque los estudios in vitro demostraron que los dímeros de CD20 pueden formarse sin la unión de anticuerpos, la evaluación cuantitativa de la dimerización de CD20 en células no tratadas actualmente es limitada.

Aquí aplicamos RESI para estudiar la disposición molecular de CD20 en células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas transitoriamente con mEGFP-CD20, utilizando cuatro rondas de intercambio de sonda en un tiempo total de imagen de 4,4 h. En la vista general limitada por difracción y en la imagen de superresolución de DNA-PAINT de las células no tratadas, el CD20 apareció distribuido homogéneamente (Fig. 4a, b (arriba) y datos extendidos, Fig. 10a), mientras que las células tratadas con RTX exhibieron aparentes grupos de CD20 (Fig. 4b (abajo) y datos extendidos Figs. 11a y 12a).

a, Imagen general limitada por difracción y DNA-PAINT de células CHO que expresan mEGFP-CD20 marcadas con nanocuerpos anti-GFP. b, Imagen de PINTURA de ADN ampliada que muestra receptores CD20 aparentemente distribuidos al azar para células no tratadas (arriba) y disposición de receptores agrupados para células tratadas con RTX (abajo). c, Comparación de DNA-PAINT y RESI para células no tratadas y tratadas con RTX que muestran pares de receptores espaciados por debajo de 10 nm en las imágenes RESI, que no se pueden resolver con DNA-PAINT. d, los datos de RESI sugieren que las proteínas CD20 ocurren en dímeros (espaciados en dímero d), que a su vez se distribuyen de acuerdo con la aleatoriedad espacial completa (CSR; distancias entre dímeros, dCSR) en células no tratadas. Se observaron cadenas de dímeros después de la administración de RTX. e, Análisis de células completas de los primeros NND de los receptores CD20 (se muestran histogramas de distancias y estimación de la densidad del kernel). Solo RESI, pero no DNA-PAINT, permite la detección rutinaria de distancias inferiores a 10 nm entre proteínas. Mientras que DNA-PAINT sobrestima la distancia del dímero, RESI muestra una distancia limitada por etiqueta de 13,5 nm (consulte el texto principal para la discusión). f, el ajuste de los datos RESI NND de e a un modelo numérico revela dímeros y monómeros CD20. g, los receptores CD20 en células no tratadas mostraron del segundo al cuarto NND consistentes con CSR, excluyendo así la presencia de complejos proteicos de orden superior. h, los receptores CD20 en las células tratadas con RTX, sin embargo, mostraron del primero al cuarto NND, lo que es inconsistente con la aleatoriedad espacial completa.

La comparación de DNA-PAINT y RESI para células no tratadas y tratadas con RTX muestra pares de CD20 espaciados por debajo de 10 nm en las imágenes RESI (Fig. 4c, derecha) que no se pudieron resolver con DNA-PAINT (Fig. 4c, izquierda) . Las imágenes RESI sugieren que CD20 está presente en dímeros y estructuras de orden superior en forma de cadena en células no tratadas y tratadas con RTX, respectivamente (Fig. 4d).

Para evaluar cuantitativamente la existencia de dímeros en células no tratadas, realizamos el primer análisis de distancia del vecino más cercano (NND) para datos de DNA-PAINT y RESI, demostrando distribuciones no aleatorias en ambos casos (Fig. 4e). RESI con una precisión de localización de 1 nm muestra una fracción sustancial de distancias inferiores a 10 nm en el histograma NND, lo que permite una evaluación cuantitativa del grado de dimerización de CD20. Realizamos simulaciones numéricas y un ajuste de mínimos cuadrados (Métodos) que arrojaron una composición de 53 ± 1 % de monómeros y 47 ± 1 % de dímeros con una distancia intradímera promedio de 13,5 ± 0,3 nm (Fig. 4f, línea continua). A modo de comparación, simulamos las distribuciones de NND correspondientes a una población de 100 % de monómeros (Fig. 4f, línea de puntos), lo que demuestra aún más que las moléculas CD20 no están presentes únicamente como monómeros. Debido a que todas las distribuciones de NND, excepto el primer orden, son consistentes con una distribución aleatoria espacial completa (CSR) en la densidad medida experimentalmente, excluimos la presencia de ensamblajes de orden superior para CD20 no tratado (Fig. 4g). Nuestros hallazgos presentan evidencia experimental cuantitativa de que CD20 existe como dímeros en una membrana celular intacta.

Por el contrario, el análisis RESI de CD20 en células tratadas con RTX arrojó distribuciones NND primera a cuarta inconsistentes con un modelo CSR (Fig. 4h y Datos extendidos Fig. 12d, e). Esto sugiere una disposición de orden superior de las moléculas CD20 después del tratamiento con RTX y confirma modelos recientes derivados de crio-EM37,38.

Finalmente, probamos la existencia de arreglos hexaméricos en forma de anillo en comparación con simulaciones numéricas (Datos extendidos Fig. 13). Las características de los grupos de CD20 detectados experimentalmente sugieren la ausencia de hexámeros aislados y respaldan la hipótesis de estructuras predominantemente lineales en forma de cadena (Datos extendidos Fig. 13h).

Presentamos RESI, un enfoque conceptualmente nuevo en SMLM para mejorar la resolución espacial de la microscopía óptica a la escala de Ångström. RESI logra esto mediante la combinación de múltiples localizaciones de objetivos únicos para obtener una imagen de "súper súper resolución" después de separar sus localizaciones mediante imágenes secuenciales (por ejemplo, utilizando sondas con código de barras de ADN).

De esta manera, la precisión RESI, y por lo tanto la resolución, escala no solo con la cantidad de fotones (N) detectados por localización, sino también con la cantidad de localizaciones (K) adquiridas por objetivo. RESI proporciona una nueva ley de escalado de precisión: \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM}}}}{\sqrt{K} }\approx \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{K}\sqrt{N}}\). Esto se aplica si un número suficientemente grande de secuencias de etiquetado ortogonales y, por lo tanto, las rondas de imágenes garantizan grupos de localizaciones adecuadamente espaciados (Datos extendidos Fig. 14). Es importante destacar que la mejora de la resolución es isotrópica en tres dimensiones. Para nuestra implementación experimental actual, RESI aborda la resolución de la biología estructural con un enfoque completamente óptico en células intactas utilizando reactivos de etiquetado disponibles en el mercado y un microscopio de fluorescencia invertido simple operado en condiciones ambientales. Pudimos demostrar experimentalmente la resolución espacial de Ångström por debajo del tamaño físico de un tinte. Esto se logró debido a tres ventajas específicas de DNA-PAINT que conducen a un muestreo objetivo imparcial: (1) la flexibilidad rotacional de la hebra de acoplamiento unida al objetivo (incluso en el caso de motivos de secuencia repetitiva más largos32); (2) el dipolo que gira libremente del tinte unido a la secuencia del generador de imágenes; y (3) el hecho de que dos generadores de imágenes adyacentes nunca están presentes simultáneamente.

Además, debido a que las imágenes RESI no se obtienen de localizaciones únicas sino de grupos de localizaciones por objetivo, el método presenta una característica robusta única en comparación con otras técnicas SMLM: cambia el enfoque de la mejora de la precisión óptica únicamente (σOPT) a la mejora de la precisión general. (\({\sigma }_{{\rm{SMLM}}}\approx \sqrt{{{\sigma }_{{\rm{OPT}}}}^{2}+{{\sigma }_{ {\rm{MEC}}}}^{2}}\)) promediando los efectos de incertidumbre de la inestabilidad mecánica (σMEC), siempre que esta última se distribuya normalmente.

Con RESI, medimos áreas de 67 × 67 μm2 en 100 min, lo que lo hace aplicable como una herramienta de rendimiento suficientemente alto para biología celular. La resolución de patrones de receptores con resolución de una sola proteína podría permitir el "diagnóstico espacial" como un método de preselección para tratamientos personalizados y servir como una herramienta para el descubrimiento biomédico de terapias con patrones, por ejemplo, al guiar los principios de diseño de fármacos.

El rendimiento y la precisión de RESI podrían mejorarse aún más con los avances en los enfoques de etiquetado intramolecular, como los aminoácidos no naturales ortogonales39. Por lo tanto, RESI está preparado para cerrar la brecha entre la microscopía de superresolución de fluorescencia 3D en células enteras intactas y los estudios estructurales crio-EM de complejos supramoleculares individuales, introduciendo un cambio de paradigma en las imágenes de fluorescencia al llevar la microscopía óptica a resoluciones de Ångström.

Los oligonucleótidos de ADN no modificados, así como los oligonucleótidos de ADN modificados con azida C3 y Cy3B, se adquirieron de MWG Eurofins y Metabion. El andamio M13mp18 y p7560 se obtuvo de Tilibit. Cloruro de magnesio (1 M, n.° AM9530G), cloruro de sodio (5 M, n.° AM9759), agua ultrapura (n.° 10977-035), Tris (1 M, pH 8,0, n.° AM9855G), EDTA (0,5 M, pH 8,0, n.º AM9260G) y PBS 10x (n.º 70011051) de Thermo Fisher Scientific. BSA (no. A4503-10G) se ordenó a Sigma-Aldrich. Triton X-100 (n.º 6683.1) se compró a Carl Roth. El hidróxido de sodio (nº 31627.290) se adquirió de VWR. El paraformaldehído (nº 15710) y el glutaraldehído (nº 16220) se obtuvieron de Electron Microscopy Sciences. Tween-20 (no. P9416-50ML), glicerol (no. 65516-500 ml), metanol (no. 32213-2.5L), protocatechuate 3,4-dioxygenase pseudomonas (PCD, no. P8279), 3,4- ácido dihidroxibenzoico (PCA, n.° 37580-25G-F) y ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetra-metilcromano-2-carboxílico (trolox, n.° 238813-5G) se ordenaron a Sigma-Aldrich. La neutravidina (n.º 31000) se adquirió de Thermo Fisher Scientific. BSA marcado con biotina (nº A8549) y azida de sodio (nº 769320) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Se adquirieron cubreobjetos (nº 0107032) y portaobjetos de vidrio (nº 10756991) de Marienfeld y Thermo Fisher Scientific, respectivamente. Suero fetal bovino (FBS, n.° 10500-064), 1× PBS (pH 7,2, n.° 20012-019), 0,05 % de tripsina-EDTA (n.° 25300-054), ADN de esperma de salmón (n.° 15632011), OptiMEM (n.º 31985062) y Lipofectamine LTX (n.º A12621) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. Se encargaron nanopartículas de oro (90 nm, n.º G-90-100) a Cytodiagnostics. Los nanocuerpos contra GFP (clon 1H1) con una única cisteína ectópica en el extremo C para la conjugación específica del sitio se adquirieron de Nanotag Biotechnologies. Se adquirió DBCO-PEG4-maleimida (n.º CLK-A108P) de Jena Bioscience.

Se usaron los siguientes tampones para la preparación de muestras y la obtención de imágenes.

Tampón A: Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 100 mM y Tween-20 al 0,05 %

Tampón B: MgCl2 10 mM, Tris-HCl 5 mM pH 8,0, EDTA 1 mM y Tween-20 al 0,05 % pH 8,0

Tampón C: PBS 1x, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM pH 7,4, Tween al 0,02 %, opcionalmente complementado con trolox 1x, PCA 1x y PCD 1x

Tampón de bloqueo: PBS 1x, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,02 %, NaN3 al 0,05 %, BSA al 2 %, 0,05 mg ml–1 de ADN de esperma de salmón cortado

Tampón de plegamiento de origami de ADN bidimensional (2D): Tris 10 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 12,5 mM pH 8,0

Tampón de plegamiento de origami de ADN 3D: Tris 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 5 mM, MgCl2 20 mM pH 8,0

Tampón TA 1×: Tris 40 mM pH 8,0, ácido acético 20 mM

Se preparó Trolox (100x) mediante la adición de 100 mg de Trolox a 430 μl de metanol al 100 % y 345 μl de NaOH 1 M en 3,2 ml de agua. Se preparó PCA (40x) mezclando 154 mg de PCA en 10 ml de agua y NaOH y ajustando el pH a 9,0. Se preparó PCD (100x) mediante la adición de 9,3 mg de PCD a 13,3 ml de tampón (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 50%).

Se usaron cuatro motivos de secuencias de ADN ortogonales para marcar objetivos en cuatro rondas RESI. Los hilos de acoplamiento fueron 5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCTCCT), 5xR2 (ACCACCACCACCACCACCA), 7xR3 (CTCTCTCTCTCTCTCTCTC) y 7xR4 (ACACACACACACACACACA). Los generadores de imágenes respectivos fueron R1 (AGGAGGA-Cy3B), R2 (TGGTGGT-Cy3B), R3 (GAGAGAG-Cy3B) y R4 (TGTGGGT-Cy3B). El diseño del origami 2D RESI requería la extensión del sitio R1 en el extremo 5 'de modo que los hilos de acoplamiento adyacentes R1 y R3 pudieran estar separados por un solo par de bases. Por lo tanto, se utilizaron la cadena de acoplamiento 5 '5xR1 (TCCTCCTCCTCCTCCTCCT) y el generador de imágenes 5' R1 (Cy3B-AGGAGGA) en lugar de las versiones 3 'para ambos origamis de ADN 2D.

Todas las estructuras de origami de ADN 2D se diseñaron en caDNAno40. El autoensamblaje de origami de ADN se logró en una mezcla de reacción de un solo recipiente con un volumen total de 40 μl, que consta de una cadena de andamio de 10 nM (para ver la secuencia, consulte los Datos complementarios 2), grapas plegables de 100 nM (Datos complementarios 1), 500 Grapas biotiniladas nM (Datos complementarios 1) y hebras de grapas 1 μM con extensiones del sitio de acoplamiento (Datos complementarios 1) en tampón de plegado de origami de ADN 2D. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a una rampa de recocido térmico utilizando un termociclador. Primero se incubó a 80 °C por 5 min, se enfrió usando un gradiente de temperatura de 60 a 4 °C en pasos de 1 °C por 3.21 min y finalmente se mantuvo a 4 °C.

La estructura del disco de origami de ADN 3D se diseñó en caDNAno40. El autoensamblaje del disco de origami de ADN se logró en una mezcla de reacción de un solo recipiente de 50 µl de volumen total, que constaba de una cadena de andamio p7560 de 20 nM (para ver la secuencia, consulte los Datos complementarios 3), grapas de plegado central de 200 nM (Datos complementarios 1) , secuencias de grapas de 200 nM sin extensión de mango (datos complementarios 1), grapas biotiniladas de 500 nM (datos complementarios 1), cadenas de grapas de 2 μM con extensiones de sitio de acoplamiento R4 y hebras de grapas de 4 μM con extensiones de sitio de acoplamiento R1 o R3 (datos complementarios 1) en tampón de plegado de origami de ADN 3D. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a una rampa de recocido térmico utilizando un termociclador. Primero se incubó a 80 °C durante 5 min, luego se enfrió usando un gradiente de temperatura de 60 °C a 20 °C en pasos de 1 °C h–1 y finalmente se mantuvo a 20 °C.

Después del autoensamblaje, las estructuras se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa (1,5 % de agarosa, 1x TA, 10 mM MgCl2, 0,5x SybrSafe) a 4,5 V cm–1 durante 1,5 h. Las bandas de gel se cortaron, trituraron y el origami se almacenó en tubos Eppendorf de baja unión a -20 °C.

Para la preparación de la muestra, se adjuntó un portaobjetos de seis canales sin fondo (ibidi, n.º 80608) a un cubreobjetos. Primero, se lavaron en la cámara 80 μl de BSA marcado con biotina (1 mg ml–1, disuelto en tampón A) y se incubó durante 5 min. A continuación, la cámara se lavó con 360 μl de tampón A. A continuación, se vertió en la cámara un volumen de 100 μl de neutravidina (0,1 mg ml–1, disueltos en el tampón A) y se permitió que se uniera durante 5 min. Después de lavar con 180 μl de tampón A y posteriormente con 360 μl de tampón B, se lavaron en la cámara 80 μl de estructuras de ADN marcadas con biotina (aproximadamente 200 pM) en el tampón B y se incubaron durante 5 min. Para la medición del disco de origami de ADN, se incubaron juntas estructuras de origami de ADN 2D adicionales con 12 sitios objetivo9 separados por 20 nm, y el origami de disco 3D sirvió como fiduciales para la corrección de deriva. Después de la incubación del origami de ADN, la cámara se lavó con 540 μl de tampón B. Para las estructuras de discos de origami de ADN, se enjuagaron 150 μl de nanopartículas de oro (diluidas 1:10 en el tampón B) y se incubaron durante 5 minutos antes de lavar con 540 μl de tampón B. Finalmente, se lavaron en la cámara 180 μl de la solución generadora de imágenes en el tampón B. La cámara permaneció llena con solución generadora de imágenes y luego se realizó la formación de imágenes. Entre rondas de imágenes, la muestra se lavó tres veces con 1 ml de tampón B hasta que no se detectó ninguna señal residual de la solución de imágenes anterior. Luego, se introdujo la siguiente solución de generación de imágenes. Para RESI, se realizaron dos rondas de generación de imágenes con los generadores de imágenes R1 y R4 presentes en la ronda 1 y los generadores de imágenes R3 y R4 en la ronda 2 (R1 y R3 sondean los sitios de interés para RESI y R4 sirve para fines de alineación).

Los nanocuerpos se conjugaron como se describió anteriormente32. Los nanocuerpos no conjugados se descongelaron en hielo, luego se agregó un exceso molar de 20 veces del enlazador bifuncional DBCO-PEG4-maleimida y se hizo reaccionar durante 2 h en hielo. El enlazador sin reaccionar se eliminó mediante intercambio de tampón a PBS utilizando filtros centrífugos Amicon (10.000 MWCO). Los nanocuerpos modificados con DBCO se hicieron reaccionar con un exceso molar 5x de ADN funcionalizado con azida (R1, R2, R3 y R4) durante la noche a 4 °C. La proteína no conjugada y el ADN libre se eliminaron mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando un sistema puro ÄKTA equipado con una columna Resource Q de 1 ml.

Se cultivaron células CHO (CCL-61, ATCC) en medio F-12K de Gibco Ham (Kaighn) suplementado con FBS al 10% (nº 11573397, Gibco). Se cultivaron células U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP (obsequio de los laboratorios Ries y Ellenberg) en medio 5A de McCoy (Thermo Fisher Scientific, n.º 16600082) suplementado con FBS al 10 %. Las células se pasaron cada 2 o 3 días usando tripsina-EDTA.

Las células U2OS-CRISPR-Nup96-mEGFP se sembraron en cámaras con fondo de vidrio alto de ocho pocillos ibidi (n.º 80807) a una densidad de 30 000 cm–2. Las células se fijaron con paraformaldehído al 2,4 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, las células se lavaron tres veces con PBS. Se incubaron nanopartículas de oro (200 μl) durante 5 min y se lavaron tres veces con PBS. El bloqueo y la permeabilización se realizaron con Triton X-100 al 0,25 % en tampón de bloqueo durante 90 min. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con nanocuerpos anti-GFP 100 nM en tampón de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente. Para habilitar RESI, la solución de nanocuerpos constaba de nanocuerpos anti-GFP acoplados a cadena de acoplamiento 25 nM R1, R2, R3 y R4 con una concentración total de nanocuerpos de 100 nM. Los nanocuerpos no unidos se eliminaron lavando tres veces con PBS, seguido de un lavado una vez con tampón C durante 10 min. La posfijación se realizó con paraformaldehído al 2,4% en PBS durante 15 min. Después de lavar 3 veces con PBS, la solución generadora de imágenes en el tampón C se lavó en la cámara. Entre las rondas de imágenes, la muestra se lavó con 1–2 ml de PBS hasta que no se detectó ninguna señal residual de la solución del generador de imágenes anterior. Luego, se introdujo la siguiente solución de generación de imágenes. En primer lugar, se agregaron simultáneamente a la muestra los generadores de imágenes R1, R2, R3 y R4 para realizar una medición estándar de DNA-PAINT; luego, las imágenes RESI se realizaron a través de cuatro rondas de imágenes posteriores con solo uno de los generadores de imágenes.

Se clonó mEGFP-Alfa-CD20 mediante la inserción de Alfa-CD20 en el plásmido mEGFP-C1 (n.º 54759, Addgene). Se amplificó un gblock Alfa-CD20 (obtenido de Integrated DNA Technologies) con los cebadores cggcatggacgagct y gtacaagtccgga y, tras el corte con las enzimas de restricción BsrGI y BamHI, se realizó el ensamblaje Gibson (2x mix, NEB).

Las células CHO se sembraron en cámaras con fondo de vidrio alto de ocho pocillos ibidi (n.º 80807) el día antes de la transfección a una densidad de 15 000 cm–2. La transfección con mEGFP-CD20 se llevó a cabo con Lipofectamine LTX como especifica el fabricante. Se permitió que las células CHO expresaran mEGFP-CD20 durante 16 a 24 h. Luego, el medio se reemplazó con medio F-12K fresco + FBS al 10 % (en el caso no tratado) o con medio F-12K + FBS al 10 % + 10 ug ml–1 RTX-Alexa 647 (regalo de Roche Glycart) ( en el caso tratado con RTX), seguido de incubación durante 30 min. Después de lavar dos veces con medio fresco durante 5 min, las células se fijaron con 250 µl de PFA al 4 % precalentado + glutaraldehído al 0,1 % en PBS durante 15 min. Las células CHO se lavaron tres veces con PBS y se extinguieron con Tris 100 mM pH 8,0 durante 5 min. La permeabilización se llevó a cabo durante 5 min con Triton X-100 al 0,2% en PBS, seguido de tres lavados con PBS. Las células se bloquearon en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Los nanocuerpos anti-GFP se incubaron a una concentración total de 25 nM durante la noche a 4 °C; para RESI con cuatro rondas, esto produjo 6,25 nM cada uno de GFP-Nb-R1/2/3/4. Después de lavar tres veces con PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos, las células se fijaron posteriormente con PFA al 4 % a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de lavado y fijación posterior como se describe anteriormente. Las nanopartículas de oro (90 nm) se diluyeron 1:3 en PBS y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente y la muestra se lavó dos veces con PBS para eliminar el oro no unido. La solución de generador de imágenes en el tampón C para la primera ronda se incubó durante 5 minutos y luego se reemplazó con un generador de imágenes nuevo, después de lo cual se inició la primera ronda de adquisición. Entre las rondas de imágenes, la muestra se lavó con al menos 2 ml de PBS hasta que no se detectó ninguna señal residual de la solución del generador de imágenes anterior. Luego, se introdujo la siguiente solución de generación de imágenes. Las imágenes RESI se realizaron a través de cuatro rondas de imágenes posteriores con solo uno de los generadores de imágenes. En la ronda final de obtención de imágenes, se agregaron simultáneamente a la muestra los generadores de imágenes R1, R2, R3 y R4 para realizar una medición estándar de DNA-PAINT.

Las imágenes de fluorescencia se llevaron a cabo utilizando un microscopio invertido (Nikon Instruments, Eclipse Ti2) con Perfect Focus System, aplicando una configuración TIRF de tipo objetivo equipada con un objetivo de inmersión en aceite (Nikon Instruments, Apo SR TIRF ×100/apertura numérica 1,49, aceite). Se usó un láser de 560 nm (MPB Communications, 1 W) para la excitación. El rayo láser se pasó a través de un filtro de limpieza (Chroma Technology, n.º ZET561/10) y se acopló al objetivo del microscopio usando un divisor de haz (Chroma Technology, n.º ZT561rdc). La fluorescencia se filtró espectralmente con un filtro de emisión (Chroma Technology, n.º ET600/50m y ET575lp) y se tomó una imagen en una cámara sCMOS (Andor, Zyla 4.2 Plus) sin aumento adicional, lo que resultó en un tamaño de píxel efectivo de 130 nm (después de 2 × 2 clasificación). La velocidad de lectura se fijó en 200 MHz. Las imágenes se adquirieron eligiendo una región de interés de tamaño 512 × 512 píxeles. Las imágenes en 3D se realizaron utilizando una lente cilíndrica (Nikon Instruments, N-STORM) en la ruta de detección. Los datos de microscopía sin procesar se adquirieron utilizando μManager41 (v.2.0.1). Se utilizó iluminación de reflexión interna total para datos de origami de ADN 2D y 3D, así como para la adquisición de CD20. Se empleó iluminación de hoja óptica laminada y altamente inclinada (HILO) para la adquisición de datos NPC. Las condiciones de imagen detalladas para los experimentos respectivos se muestran en la Tabla 1 de datos ampliados.

Debido a la heterogeneidad del objetivo y la muestra, la concentración óptima del generador de imágenes, c, utilizada para lograr un parpadeo disperso varía. Aquí usamos concentraciones de 100 pM (Nup96) a 800 pM (origami de ADN). Las concentraciones óptimas del generador de imágenes se determinaron visualmente para cada muestra. Las concentraciones se alteraron hasta que el parpadeo fue frecuente pero lo suficientemente escaso para lograr una buena resolución de DNA-PAINT.

El número promedio de eventos de unión esperados por sitio de unión durante una medición de DNA-PAINT viene dado por la duración de la medición tmedida y el tiempo medio de oscuridad τdark (definido como \({\tau }_{{\rm{dark}}} =\frac{1}{{k}_{{\rm{on}}}\times c}\), siendo kon la tasa de activación de una cadena de imágenes dada) como:

El número promedio de localizaciones por evento vinculante viene dado por el tiempo medio de brillo τbright y el tiempo de exposición de la cámara como texposure

Por lo tanto, la cantidad promedio de localizaciones esperadas por sitio de unión en el transcurso de la medición es

De ello se deduce que el tiempo de adquisición total necesario para recopilar localizaciones nloc es, en promedio,

El número necesario de localizaciones, nloc, se calcula usando \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{DNA}} \mbox{-} { \rm{PAINT}}}}{\sqrt{{n}_{{\rm{loc}}}}}\), y por lo tanto \({n}_{{\rm{loc}}}={\ izquierda(\frac{{\sigma }_{{\rm{ADN}} \mbox{-} {\rm{PAINT}}}}{{\sigma }_{{\rm{RESI}}}}\right )}^{2}\) con la precisión de localización de DNA-PAINT σDNA-PAINT.

Para las concentraciones esperadas del generador de imágenes entre 50 y 800 pM, los tiempos de exposición entre 100 y 200 ms y la cinética informada previamente32, los tiempos requeridos para recolectar 16 localizaciones (precisión RESI de 1 nm dado σDNA-PAINT = 4 nm) varían entre 42 s (R2, 800 pM, tiempo de exposición de 100 ms) y 314 min (R5, 50 pM, tiempo de exposición de 200 ms).

Los datos de fluorescencia sin procesar se sometieron a una reconstrucción de superresolución utilizando el paquete de software Picasso9 (última versión disponible en https://github.com/jungmannlab/picasso). La corrección de la deriva se realizó con una correlación cruzada redundante y partículas de oro como fiduciales para experimentos celulares, o con sitios de acoplamiento únicos de DNA-PAINT como fiduciales para experimentos de origami.

La alineación de las rondas de imágenes posteriores se realizó de forma iterativa en Picasso9, comenzando con una correlación cruzada redundante y seguida de una alineación fiduciaria de oro para experimentos celulares. Cada origami de ADN estaba equipado con sitios de acoplamiento DNA-PAINT adicionales que se tomaron imágenes simultáneamente con los sitios de interés en todas las rondas de imágenes, lo que permitió su uso como referencias. En primer lugar, se realizaron correlaciones cruzadas redundantes (medidas de origami 2D y 3D) y alineación dorada (medidas 3D) en Picasso Render. Para corregir el movimiento nanoscópico del origami de ADN individual durante el intercambio de tampones, la alineación de canales no solo se realizó en el campo de visión completo, sino que, además, se seleccionaron pequeñas regiones de interés que contenían solo un origami de ADN. Dentro de cada región de interés, la alineación se realizó a través de los sitios de acoplamiento fiduciarios del origami de ADN. Esto se realizó fuera de Picasso en un script de Python personalizado, no solo para encontrar la traducción óptima entre canales, sino también para corregir posibles rotaciones del origami de ADN.

Después de la alineación del canal, los datos de DNA-PAINT se analizaron utilizando un algoritmo de agrupación personalizado para cada ronda de imágenes. Este algoritmo se basa en el hecho de que, en DNA-PAINT, las localizaciones son medidas independientes de la posición de una molécula objetivo y se observa que tienen una distribución gaussiana. Para asignar localizaciones a una molécula objetivo específica, primero usamos un método de ascenso de gradiente para encontrar el centro de una nube de localización para cada objetivo. Luego asignamos todas las localizaciones distribuidas circularmente alrededor del punto central a la misma molécula objetivo. Esta es una aproximación válida porque, debido a la reducción de la densidad efectiva de objetivos por el enfoque de imágenes secuenciales de RESI, la mayoría de las nubes de localización de objetivos individuales están suficientemente separadas.

El algoritmo de agrupación utiliza dos parámetros de entrada: el radio r, que establece el tamaño final de las agrupaciones y define un entorno circular alrededor de cada localización, y la cantidad mínima de localizaciones, nmin, que representa un umbral inferior para la cantidad de localizaciones de DNA-PAINT en cualquier grupo.

Primero, se calcula el número de localizaciones vecinas dentro de la distancia r de cada localización. Si una localización dada tiene más vecinos dentro de su radio r que todas las localizaciones vecinas, se considera un máximo local. Si hay más de nmin localizaciones dentro de un círculo de radio r alrededor de dicho máximo local, estas localizaciones se asignan al mismo grupo; el resto no se considera parte de un conglomerado y se omite del análisis posterior.

Se realiza un filtrado adicional de los grupos para excluir los grupos que se originan por la adherencia inespecífica de generadores de imágenes a la muestra. En primer lugar, se calcula el fotograma medio (valor medio de los números de fotogramas en los que se produjeron las localizaciones) de todas las localizaciones asignadas al mismo grupo. En el caso de parpadeo repetitivo, se espera que el cuadro medio sea alrededor de la mitad del número total de cuadros42. Por lo tanto, el algoritmo excluye todos los grupos con un marco medio en el primer o el último 20 % de los marcos. En segundo lugar, los eventos de bloqueo en la mitad del tiempo de adquisición se pueden identificar dividiendo el tiempo de adquisición en 20 ventanas de tiempo, cada una de las cuales contiene el 5 % de los fotogramas. Si alguna de estas ventanas de tiempo contiene más del 80 % de las localizaciones en el clúster, se excluye como un evento persistente.

La elección del radio de agrupación r y el umbral nmin dependen de las respectivas condiciones experimentales. Se puede estimar un valor adecuado para nmin seleccionando nubes de localización que se originen a partir de moléculas objetivo únicas (es decir, bien separadas) en Picasso Render, exportando propiedades de selección y trazando un histograma del número de localizaciones en cada selección. nmin se elige para diferenciar entre poblaciones correspondientes a objetivos únicos y localizaciones de fondo.

El radio r se escala con el tamaño de las nubes de localización y, por lo tanto, con la precisión de la localización. Si se elige un valor demasiado grande, es posible que los clústeres adyacentes no se separen; si r es demasiado pequeño, puede ocurrir un 'subagrupamiento' dentro de una localización. Esto último también se traduce en un pico en NND al doble del radio de agrupación. Un buen valor inicial a priori para r está representado por aproximadamente el doble de la precisión de localización de la medición subyacente de DNA-PAINT. Picasso Render ofrece una herramienta (Test Clusterer) en la que se puede probar el efecto de diferentes parámetros de agrupamiento para una pequeña región de interés.

Para el agrupamiento 3D, se introduce un radio adicional para la dirección z porque la dispersión de las localizaciones en z es aproximadamente dos veces mayor en comparación con x e y.

Después del análisis de conglomerados, los centros de los grupos de localización de DNA-PAINT se calcularon como medias ponderadas (wtd) empleando las precisiones de localización inversa al cuadrado \((\frac{1}{{{\text{lp}}}^{2} })\) como pesos. Para las coordenadas x e y:

Para las coordenadas z, se utiliza una media estándar sin pesos para calcular las posiciones z. La precisión de la localización RESI resultante es el sem ponderado de las localizaciones agrupadas subyacentes:

La elección de \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) como pesos se basa en el siguiente argumento: bajo la hipótesis de que las localizaciones son independientes y normalmente distribuidas con la misma media, la media ponderada basada en sobre varianzas inversas como pesos es el estimador de máxima verosimilitud de la media de todo el conjunto de localizaciones. Por lo tanto, la varianza de la media ponderada es mínima (el estimador es óptimo) cuando las varianzas inversas de las medidas individuales \(1/{{\text{lp}}}^{2}\) se eligen como pesos.

Finalmente, tomamos el promedio de los sem x e y resultantes como la precisión final de cada localización RESI. Para las coordenadas z, la precisión se estima en dos veces la precisión xy. Guardar las localizaciones RESI en un archivo hdf5 de Picasso nos permitió representarlas como gaussianas con sd correspondiente a su precisión respectiva.

Para evaluar el desempeño de RESI, se realizaron simulaciones numéricas in silico. El algoritmo consta de los siguientes pasos.

Se genera una cuadrícula de posiciones definidas de los sitios de unión (realidad del terreno). Por lo general, se generó una cuadrícula de posiciones (Datos extendidos Fig. 1a, arriba a la izquierda).

Las localizaciones SMLM (DNA-PAINT) se simulan como muestras de una distribución gaussiana 2D con σ = σSMLM. Se genera una gran cantidad (M) de localizaciones por sitio de unión (Datos extendidos Fig. 1a, arriba a la derecha).

Para cada sitio de unión, se seleccionan al azar subconjuntos de localizaciones K (K << M). Esto da como resultado \(n=\frac{M}{K}\) subconjuntos de localizaciones SMLM (Datos extendidos Fig. 1a, abajo a la izquierda) que luego se promedian para generar n localizaciones RESI (Datos extendidos Fig. 1a, abajo a la derecha) .

Las localizaciones RESI resultantes se muestran luego en un histograma (Datos extendidos Fig. 1b) y se calcula la traza (tr) de la matriz de covarianza. La precisión RESI se estima como \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\sqrt{\frac{1}{2}tr({\rm{cov}}\left(x,y\right ))}\) (Datos extendidos Fig. 1c). Esta definición se ha utilizado anteriormente en el campo como una métrica escalar para la varianza 2D8.

Los pasos 3 y 4 se repiten para diferentes valores de K para estudiar numéricamente σ = σRESI(K).

Para evaluar la precisión de RESI en datos experimentales, se utilizó un método análogo. Brevemente, el total M de localizaciones de DNA-PAINT de cada grupo correspondiente a un único sitio de unión se volvió a muestrear aleatoriamente en subconjuntos de localizaciones K, luego se realizaron los pasos 4 y 5 anteriores para evaluar σRESI. El σRESI trazado en la Fig. 3d es el valor promedio de todos los sitios de unión únicos en el conjunto de datos. Las barras de error representan la sd de los diferentes valores de σRESI calculados para diferentes sitios de unión.

Tenga en cuenta que este análisis solo se puede realizar para que K << M tenga suficientes localizaciones RESI de \(n=\frac{M}{K}\) para una estimación estadísticamente significativa. Dado que la localización RESI final tiene en cuenta todas las localizaciones M DNA-PAINT, la precisión final se extrapola como \({\sigma }_{{\rm{RESI}}}=\frac{{\sigma }_{{\rm{SMLM }}}}{\raíz cuadrada{M}}\).

En RESI, la escasez de sitios de unión en la muestra se logra marcando una sola especie de biomoléculas con diferentes secuencias de ADN ortogonales. El proceso de marcaje se realiza de manera estocástica: n diferentes marcadores (por ejemplo, nanocuerpos conjugados con ADN) dirigidos a la misma especie de proteína se incuban simultáneamente en la muestra y, por lo tanto, la probabilidad de que cada proteína individual se marque con una determinada secuencia i (i = 1, …, n) es \({p}_{i}=\frac{1}{n}\), dado que se utiliza la misma concentración de cada marcador. Posteriormente, se realizan n rondas de imágenes para registrar todos los grupos de localizaciones necesarias para obtener la imagen RESI final.

El número mínimo de etiquetas (n) y rondas necesarias para lograr una escasez suficiente de sitios de unión en cada ronda de imágenes dependerá principalmente de tres factores: precisión y densidad de localización SMLM y la disposición molecular de la proteína de interés. Aquí describimos cómo estos parámetros afectan los resultados finales de RESI utilizando algunos ejemplos prácticos.

Un caso de estudio típico es el de proteínas individuales dispuestas en dímeros, que a su vez presentan otra organización espacial específica en el espacio. Este es el caso, por ejemplo, del Nup96 en el NPC. En este caso, el marcaje estocástico tiene que ser tal que la probabilidad de marcar dos proteínas formando un dímero con secuencias diferentes sea suficientemente alta. Para n rondas de etiquetado/imágenes, la probabilidad es

para n = 4 rondas de etiquetado/imagen P(dif. seq.) ≈ 75%. Elegimos n = 4 para demostrar que proporciona un P(diff. seq.) relativamente alto con solo unas pocas rondas de imágenes. Notamos, sin embargo, que n> 4 podría usarse para aumentar P (diff. seq.) y, por lo tanto, para maximizar la escasez de sitios de unión marcados en cada ronda.

Para resolver un conjunto de un número arbitrario de moléculas, m, espaciadas más estrechamente que la resolución de DNA-PAINT, deben etiquetarse con n secuencias ortogonales. En general, la proporción de m moléculas marcadas con n secuencias ortogonales y, por lo tanto, la proporción de conjuntos de moléculas resolubles, sigue la ecuación

Este es un caso común, por ejemplo, para los receptores de membrana. Si las proteínas se distribuyen en forma de CSR (datos extendidos, Fig. 14a) a una densidad dada, DNA-PAINT ya puede resolver proteínas individuales que están lo suficientemente separadas de sus NN. Consideraremos que las proteínas a una distancia d = 4 × σDNA-PAINT se resuelven de manera confiable (tenga en cuenta que este criterio es significativamente más estricto que 2.35 × σDNA-PAINT). Luego, para una densidad dada, se puede calcular el histograma NND y calcular la fracción de distancias por debajo de d (Datos extendidos Fig. 14b). Esto representa la fracción de proteínas individuales, F, que no serán resueltas por DNA-PAINT. Aquí representamos F como una función tanto de la densidad como de la resolución (Datos extendidos Fig. 14c). Dicho mapa ya proporciona una herramienta para comprender el nivel de resolución SMLM necesario para resolver proteínas individuales a una densidad determinada.

RESI se puede interpretar aquí como una forma de reducir la densidad efectiva al dividir los objetivos en diferentes subconjuntos etiquetados estocásticamente. Por lo tanto, la densidad efectiva de cada ronda se reducirá de acuerdo con la fórmula \(\rho =\frac{{\rm{densidad}}}{n}\). Datos extendidos La Fig. 14d muestra cortes unidimensionales del mapa 2D para proporcionar pautas para elegir la cantidad de secuencias ortogonales (y, por lo tanto, rondas de imágenes) necesarias para poder realizar RESI de manera eficiente. Por ejemplo, para una resolución inicial de 20 nm (σ = 5 nm), que es típica de DNA-PAINT en un contexto celular, y una densidad de \({\rm{d}}{\rm{e}}{ \rm{n}}{\rm{s}}{\rm{i}}{\rm{t}}{\rm{y}}=200\,\frac{{\rm{m}}{\ rm{o}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm{c}}{\rm{u}}{\rm{l}}{\rm{e}}{\rm {s}}}{\mu {{\rm{m}}}^{2}}\) (relativamente alta), n = 4 secuencias diferentes son suficientes para proporcionar P(diff. seq.) ≈ 90% para proteínas debajo de d (Datos extendidos Fig. 14d). Estas proteínas luego serán resolubles por RESI.

Se realizó un promedio sin modelo de los datos de Nup96 para la medición de DNA-PAINT y RESI del mismo núcleo, como se describe por Wu et al.30. Los respectivos archivos hdf5 de Picasso se segmentaron en SMAP43 y se guardaron en un formato de archivo compatible para promediar empleando los complementos segmentNPC, NPCsegmentCleanup y sitenumbers2loc. A continuación, se realizó un promedio sin modelo en los archivos _sml.mat resultantes con parámetros predeterminados mediante la ejecución del script de partículasFusion.m en Matlab (disponible con el código fuente de SMAP). Los promedios mostrados corresponden al resultado de la iteración final, en la que cada punto se representa con una Gaussiana de σ = 2 nm en x, y y z.

Para interpretar los resultados de los datos de NND en células no tratadas, se realizaron simulaciones numéricas. Brevemente, se simularon dos poblaciones, una de monómeros CD20 y otra de dímeros con una distribución CSR, y luego se calcularon sus NND. El algoritmo se puede resumir de la siguiente manera:

Elección de parámetros. Densidad de monómeros: número de monómeros por unidad de área; densidad de dímeros: número de dímeros por unidad de área; distancia del dímero: distancia esperada entre las dos moléculas, incluida la construcción de marcaje; incertidumbre: variabilidad en la posición de cada molécula debido a errores de etiquetado y localización; eficiencia de etiquetado: fracción de moléculas reales que realmente se etiquetarán y medirán. La densidad observada, que tiene que coincidir con el parámetro experimental, se convierte en densidad observada = (densidad de monómeros + densidad de dímeros) × eficiencia de etiquetado. Para la cuantificación de la eficiencia de etiquetado del nanocuerpo GFP conjugado con ADN, utilizamos una línea celular CHO transfectada transitoriamente que expresa una etiqueta GFP y Alfa en el extremo C de una proteína de membrana monomérica (por ejemplo, CD86). Luego etiquetamos GFP- y Alfa-tag usando sus nanocuerpos afines conjugados con dos secuencias de acoplamiento ortogonales y realizamos dos rondas de Exchange-PAINT. Luego obtuvimos los parámetros de mejor ajuste para una muestra que comprende pares de etiquetas GFP/Alfa y etiquetas Alfa aisladas, de manera similar a cómo se realiza el análisis de dímero/monómero CD20. La proporción de estas dos poblaciones se usa luego como una estimación de la eficiencia de marcaje. Los detalles completos del enfoque de cuantificación estarán disponibles en un manuscrito actualmente en preparación.

Simulación de monómeros: se dibuja un conjunto de coordenadas espaciales con distribución CSR y densidad dada; simulación de dímeros: se dibuja un conjunto de coordenadas espaciales con distribución CSR, que representan el centro de cada dímero. Para cada centro de dímero, se generan dos posiciones con una orientación aleatoria y una distancia con el valor esperado de distancia de dímero. Se dibuja la posición de cada par de moléculas, teniendo en cuenta el parámetro de incertidumbre (extraído de una distribución gaussiana).

Se toma un subconjunto aleatorio de moléculas 'detectables' del conjunto real (fracción = eficiencia de etiquetado) para simular el proceso de etiquetado.

Los NND se calculan sobre el subconjunto de moléculas detectables.

Los parámetros densidad de monómeros = 212 μm–2, densidad de dímeros = 0 μm–2, incertidumbre = 5 nm y eficiencia de etiquetado = 50 % se utilizaron para comparar datos de células tratadas con RTX con una distribución de monómeros CSR.

Para el caso no tratado, los parámetros de mejor ajuste se obtuvieron a través de un algoritmo iterativo, no lineal, de mínimos cuadrados. La densidad observada experimentalmente (50 moléculas µm–2) se utiliza para la simulación.

Para cada conjunto de parámetros se realiza una simulación, se histograman los NND y se calcula la suma de las diferencias al cuadrado entre la simulación y el histograma experimental. Un ajuste consiste en encontrar los parámetros que minimizan la suma de las diferencias al cuadrado.

D, distancia de dímero promedio (nm)

σ_label, variabilidad introducida por el etiquetado (nm)

frac_of_dimers, fracción de dímeros (%)

Nota: frac_of_monómeros = 100 – frac_of_dimers

Ajuste grueso sobre una amplia gama de parámetros para determinar el rango de los parámetros de mejor ajuste. Rango D = 1–20 nm, σ_label = 1–20 nm, frac_of_dimers = 0–100 %.

Ajuste fino en un espacio de parámetros reducido alrededor de los resultados de mejor ajuste en el paso anterior.

Ahora se encuentran los parámetros D_opt, σ_label_opt y frac_of_dimers_opt que mejor coinciden con el modelo propuesto y los datos. En este caso resultó en D_opt = 13.5 nm, σ_label_opt = 5.5 nm, frac_of_dimers_opt = 47% (Fig. 4e,f).

Se crea M (en este caso, M = 100), se simula (utilizando los conjuntos de datos D_opt, σ_label_opt, frac_of_dimers_opt) con el mismo número de moléculas que los datos experimentales (alrededor de 21 000).

Los conjuntos de datos M se ajustan con precisión y se obtienen los parámetros de mejor ajuste D_opt, σ_label_opt y frac_of_dimers_opt. Se obtienen tres conjuntos: D_opt, σ_label_opt y frac_of_dimers_opt.

Se estudian las distribuciones de D_opt, σ_label_opt y frac_of_dimers_opt. La desviación estándar se puede utilizar como una estimación de las incertidumbres de los parámetros obtenidas en b.

Se obtienen ahora las incertidumbres de los parámetros D_opt, σ_label_opt y frac_of_dimers_opt.

Los datos de localización de este estudio están disponibles en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7795826). Los datos de microscopía sin procesar obtenidos durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

RESI se puede realizar con Picasso v.0.6.0, disponible en https://github.com/jungmannlab/picasso con la documentación proporcionada en https://picassosr.readthedocs.io/en/latest/render.html. Los scripts personalizados utilizados en este estudio están disponibles en https://github.com/jungmannlab/resi.

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Agradecemos a Y.-L. Wu y J. Ries por su valiosa ayuda con el promedio sin modelo. Damos las gracias a J. Schmied y F. Schueder útil para los debates. Agradecemos a MK Steen-Mueller e I. Glueck por corregir el manuscrito. Esta investigación fue financiada en parte por el Consejo Europeo de Investigación a través de una subvención de consolidación ERC (ReceptorPAINT, acuerdo de subvención n.º 101003275), la Fundación de Investigación Alemana a través de SFB1032 (proyecto A11, n.º 201269156), la Fundación Nacional Danesa de Investigación (Centro de Signal Patterns, DNRF135), Human Frontier Science Program a través de una subvención para jóvenes investigadores (no. HFSP RGY0065/2018), Volkswagen Foundation a través de la iniciativa 'Life?—A Fresh Scientific Approach to the Basic Principles of Life' (subvención no. 98198), la Fundación Max Planck y la Sociedad Max Planck. SS y TS reconocen el apoyo de la escuela de posgrado QBM. SCMR, IB, PRS, ASE, EMU y MTS reconocen el apoyo de la escuela de posgrado IMPRS-LS. IB agradece el apoyo financiero de Roche. LAM reconoce una beca postdoctoral del programa de investigación e innovación Horizon 20212022 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie no. 101065980.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Susanne CM Reinhardt, Luciano A. Masullo, Isabelle Baudrexel, Philipp R. Steen

Instituto Max Planck de Bioquímica, Planegg, Alemania

Susanne CM Reinhardt, Luciano A Masullo, Isabelle Baudrexel, Philipp R Steen, Rafal Kowalewski, Alexandra S Eklund, Sebastian Strauss, Eduard M Unterauer, Thomas Schlichthaerle, Maximilian T Strauss y Ralf Jungmann

Facultad de Física y Centro de Nanociencia, Universidad Ludwig Maximilian, Munich, Alemania

Susanne CM Reinhardt, Philipp R. Steen, Rafal Kowalewski, Sebastian Strauss, Eduard M. Unterauer, Thomas Schlichthaerle, Maximilian T. Strauss y Ralf Jungmann

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad Ludwig Maximilian, Munich, Alemania

Isabelle Baudrexel, Alexandra S. Eklund y Christian Klein

Roche Innovation Center Zurich, Roche Pharma Research and Early Development, Schlieren, Suiza

cristiano klein

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SCMR diseñó y realizó origami de ADN en 2D y 3D, así como experimentos Nup96, desarrolló el software de análisis y analizó origami de ADN y datos de Nup96. LAM diseñó y realizó simulaciones por computadora, contribuyó al software de análisis y analizó datos de origami de ADN, Nup96 y CD20. IB diseñó y realizó experimentos de CD20 y analizó datos de CD20. PRS diseñó y realizó experimentos de origami de ADN en 2D, contribuyó al software de análisis y analizó datos de origami de ADN y Nup96. RK y TS contribuyeron al software de análisis. SS desarrolló sondas de etiquetado. ASE, SS, EMU y MTS realizaron experimentos RESI preliminares. CK contribuyó al diseño de estudios dirigidos a CD20 y su interpretación. SCMR, LAM, IB, PRS y RJ interpretaron los datos y escribieron el manuscrito. RJ concibió el concepto, diseñó experimentos y supervisó el estudio. SCMR, LAM, IB y PRS contribuyeron por igual. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ralf Jungmann.

CK declara empleo, patentes (no relacionadas con este trabajo) y propiedad de acciones con Roche.

Nature agradece a Alistair Curd y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, se genera una cuadrícula de posiciones definidas de sitios de unión (arriba a la izquierda), las localizaciones SMLM (DNA-PAINT) se simulan como muestras de una distribución gaussiana (arriba a la derecha). Las localizaciones para un solo sitio de unión se trazaron para mayor claridad. Para cada sitio de unión, se seleccionan al azar subconjuntos de localizaciones K (extremo inferior izquierdo) y se promedian (extremo inferior derecho). Se destaca un subconjunto ejemplar y su promedio. b, las localizaciones RESI resultantes se histograman para producir imágenes a diferentes resoluciones (valores K). c, precisión de localización RESI σRESI vs K. Dependencia analítica de \(\sqrt{K}\) (línea azul) y resultados numéricos (puntos negros). Se simula un total de 1200 localizaciones SMLM por sitio. Las barras de error representan la media ± 1 sd

a, diseño de origami de ADN con seis pares de hebras de acoplamiento ortogonales con un espacio de 5 nm (R1 rojo, R3 azul) y seis hebras de acoplamiento de alineación (R4 verde). Consulte Métodos para conocer los detalles de la secuencia. b, los parámetros de adquisición de DNA-PAINT se ajustaron de manera que 5 nm no se pudieran resolver de forma consistente. c, Primera ronda de imágenes realizada con generadores de imágenes R1 (objetivo) y R4 (alineación, sitios en un círculo). d, Segunda ronda de imágenes realizada con R3 (objetivo) y generadores de imágenes de alineación (R4, sitios en un círculo). Los sitios de alineación se usaron para la alineación traslacional y rotacional entre rondas. e, RESI resuelve las distancias de 5 nm. f, La distancia y la orientación entre los hilos de acoplamiento R1 y R3 son consistentes con el diseño. g, Un promedio de 90 estructuras de origami de ADN revela resultados consistentes y un excelente rendimiento de alineación. Los números indican la distancia entre rondas.

Origami de ADN representativo de todo el campo de visión de la medición. a, Cuatro origamis de ADN, mostrados con resolución DNA-PAINT (fila superior) y resolución RESI (fila inferior). El inserto muestra un par de hilos de acoplamiento espaciados aprox. 5 nm. b, 40 origami de ADN adicionales, mostrados en resolución DNA-PAINT (filas superiores) y resolución RESI (filas inferiores).

a, diseño de origami de ADN con un par de hebras de acoplamiento ortogonales (R1 rojo, R3 azul), así como seis hebras de acoplamiento de alineación (R4 verde). Las hebras de acoplamiento se extienden desde la superficie superior e inferior del origami de ADN (inserto). b, El diseño asegura que todos menos el par de hebras de acoplamiento R1/R3 estén lo suficientemente espaciados para ser resueltos por DNA-PAINT. c, las imágenes 3D DNA-PAINT resuelven los sitios de alineación R4, apenas resuelven R1/R3 axialmente y no resuelven R1/R3 lateralmente. d, imágenes de ADN-PAINT 3D secuenciales con sitios R4 utilizados para la alineación. e, RESI resuelve R1/R3 tanto axial como lateralmente. f, Una superposición de origami de 88 ADN revela una buena alineación general a pesar de la heterogeneidad estructural. g, Promedio de 88 origamis de ADN. h, el promedio de partículas recupera la estructura con una incertidumbre de alineación de 0,7 nm CI = [0, 1,6] nm, mostrando una distancia entre las posiciones promedio de R1/R3 de 11,6 ± 0,8 nm (distancia xy: 2,5 ± 0,4 nm, z -distancia: 11,3 ± 0,8 nm), coincidiendo con las distancias diseñadas20. La misma escala se aplica a todos los paneles de aumento. IC describe el intervalo de confianza del 68%.

Origami de ADN 3D representativo de todo el campo de visión de la medición. a, Cinco origamis de ADN, mostrados con resolución DNA-PAINT (fila superior) y resolución RESI (fila inferior). La escala de colores a la derecha representa la posición z de las localizaciones. Las coordenadas z medidas para cada origami de ADN se han desplazado por una constante, de modo que la localización más baja para una estructura determinada se define en z = 0. Esto garantiza el uso completo de la gama de colores. b, 32 origami de ADN adicionales, mostrados con resolución DNA-PAINT (filas superiores) y resolución RESI (filas inferiores). Las posiciones z están coloreadas según la escala de colores del panel a.

NPC representativos de todo el campo de visión de la medición. a, Seis NPC, medidos usando DNA-PAINT (fila superior) y RESI (fila inferior). La escala de colores a la derecha representa la posición z de las localizaciones. Las coordenadas z medidas para cada NPC se han desplazado por una constante, de modo que la localización más baja para una estructura determinada se define en z = 0. Esto garantiza el uso completo de la gama de colores. b, 72 NPC adicionales, medidos usando DNA-PAINT (filas superiores) y RESI (filas inferiores). Las posiciones z están coloreadas según la escala de colores del panel a.

a, promedio sin modelo para mediciones de DNA-PAINT de Nup96 (N = 1045 NPC). Se muestra una vista isométrica en ángulo. b–d, DNA-PAINT resuelve los anillos nucleoplásmicos y citoplasmáticos y recapitula su simetría de ocho veces, pero no logra resolver las proteínas Nup96 individuales. e, Las vistas laterales de todos los pares de Nup96 en ambos anillos revelan la orientación en ángulo pero no resuelven las proteínas Nup96 individuales. f, promedio sin modelo para mediciones RESI de Nup96 (N = 1190 NPC). g-i, RESI recapitula los anillos nucleoplásmicos y citoplasmáticos, así como su simetría de ocho veces y resuelve las proteínas Nup96 adyacentes individuales en la mayoría de los casos. j, Las vistas laterales de los ocho pares de Nup96 en ambos anillos revelan la orientación en ángulo y, en algunos casos, las proteínas Nup96 individuales adyacentes. k, La estructura Cryo-EM del complejo del poro nuclear indica que una determinada proteína Nup96 tendrá vecinos espaciados a 11 nm, 39 nm, 71 nm, 93 nm y 101 nm. l, la realización de un análisis de agrupamiento y vecino más cercano para los datos de DNA-PAINT revela un pico de aprox. 40 nm, correspondiente a la distancia entre dos pares Nup96, pero no por debajo de eso. RESI, por otro lado, presenta un primer pico en aprox. 15 nm, correspondiente a la distancia entre Nup96 adyacentes teniendo en cuenta el error de enlace (tamaño de la etiqueta). m, el análisis de las distancias del primer al décimo vecino más cercano para RESI y DNA-PAINT recapitula las distancias desde (k), pero solo RESI resuelve la distancia más pequeña. Todas las barras de escala: 20 nm.

Origami de ADN representativo de todo el campo de visión de la medición. a, Cuatro origamis de ADN, mostrados con resolución DNA-PAINT (fila superior) y resolución RESI (fila inferior). Las inserciones muestran pares de hebras de acoplamiento directamente adyacentes resueltas por RESI. b, 42 origami de ADN adicionales, mostrados en resolución DNA-PAINT (filas superiores) y resolución RESI (filas inferiores).

a, origami de ADN con seis cadenas de alineación (R4 verde) y seis pares de cadenas de acoplamiento ortogonales (R1 roja, R3 azul) separadas por un par de bases. b, la representación RESI con localizaciones RESI de la ronda 1 en rojo y la ronda 2 en azul ilustra una excelente alineación. Las distancias entre las localizaciones RESI de las rondas 1 y 2 se definen como se ilustra. c, Superponer 42 origami de ADN y realizar un promedio de partículas recupera la estructura con una incertidumbre de alineación de 1,2 Å CI = [0, 4,6] Å, mostrando distancias entre las posiciones promedio de los sitios a 9,5 ± 2,6 Å (media sobre seis distancias en el promedio ± la media sobre las incertidumbres propagadas por error de las seis distancias). La misma escala se aplica a todos los paneles de aumento. IC describe el intervalo de confianza del 68%.

a, las imágenes de ADN-PAINT de células CHO que expresan mEGFP-CD20 completas, marcadas con nanocuerpos anti-GFP, muestran moléculas distribuidas homogéneamente para tres experimentos independientes. b, Las regiones ampliadas de DNA-PAINT muestran casos en los que no se pudieron resolver los dímeros. c, RESI revela pares de receptores espaciados por debajo de 10 nm, que no se pueden resolver en los casos de DNA-PAINT. d, Análisis de células completas de las distancias del primer vecino más cercano (primer NND) de los receptores CD20 (se muestran los histogramas de las distancias). Solo RESI, pero no DNA-PAINT, permite la detección rutinaria de distancias inferiores a 10 nm entre proteínas. e, la precisión de localización de RESI por debajo de 1 nm permite la detección rutinaria de distancias inferiores a 10 nm, lo que da como resultado una evaluación precisa del primer NND.

a, imagen general de DNA-PAINT de células CHO que expresan mEGFP-CD20 tratadas con RTX. b, el etiquetado con nanocuerpos anti-GFP conjugados con ADN y las imágenes con DNA-PAINT revelan una organización de orden superior después del tratamiento con RTX. RESI (recuadros i–iii) logra la resolución molecular y, por lo tanto, resuelve la disposición molecular de mEGFP-CD20. c, las imágenes de DNA-PAINT muestran moléculas CD20 agrupadas. La realización de RESI con secuencias R1, R2, R3 y R4 en cuatro rondas de imágenes separadas (codificadas por colores) permite la agrupación de localizaciones que se originan en un solo objetivo. A partir de las localizaciones agrupadas, se calcularon las localizaciones RESI, lo que permitió una verdadera resolución de proteína única.

a, imágenes de ADN-PAINT de células CHO que expresan mEGFP-CD20 completas, marcadas con nanocuerpos anti-GFP, muestran moléculas CD20 agrupadas en células tratadas con rituximab para tres experimentos independientes. b, Las regiones ampliadas de DNA-PAINT muestran mEGFP-CD20 agrupadas en disposiciones similares a cadenas. c, RESI revela pares de receptores espaciados por debajo de 10 nm dentro de los grupos, irresolubles por DNA-PAINT. d, Análisis de células completas de las distancias del primer vecino más cercano (primer NND) de los receptores CD20 unidos a Rituximab (se muestran los histogramas de las distancias). Solo RESI, pero no DNA-PAINT, permite la detección rutinaria de distancias inferiores a 10 nm entre proteínas. e, La detección de rutina de distancias inferiores a 10 nm por RESI recapitula el primer NND medido en el caso no tratado. En particular, los picos de NND medidos en las tres repeticiones son consistentes, independientemente de la densidad de la proteína.

a, Ejemplo de hexámeros de CD20 simulados en tierra (círculos azul claro, simulados como triángulos de dímeros con distancias intradímeras de 13,5 nm medidas experimentalmente) con distribución y orientación aleatorias en una superficie 2D a la densidad determinada experimentalmente. b, la incertidumbre de la etiqueta y la eficiencia de etiquetado (los círculos negros indican moléculas marcadas) se tienen en cuenta en la simulación para una comparación realista. c, Proteínas simuladas en disposiciones hexámeras representadas como gaussianas. d, hexámeros después del análisis de conglomerados DBSCAN (los colores indican conglomerados). e, imagen RESI de datos CD20 después del tratamiento con RTX. f, localizaciones RESI de datos CD20 después del análisis de conglomerados DBSCAN (los colores indican conglomerados). g, Número de moléculas por grupo detectado para los datos experimentales y los hexámeros simulados. h, métrica de circularidad de los datos experimentales y los hexámeros simulados después del análisis de casco convexo de los grupos. Notamos que la fuerte caída en 0.605 proviene de la métrica de máxima circularidad para grupos donde el casco convexo está definido por tres moléculas. En particular, la ausencia de un pico de circularidad de ~0,7 en los datos experimentales sugiere que las moléculas de CD20 no están dispuestas en estructuras hexámeras anulares aisladas.

a, Simulación ejemplar de proteínas con una distribución aleatoria espacial completa (CSR) de una densidad dada. b, Histograma de distancias de vecinos más cercanos (NND). La línea roja indica la distancia más pequeña (d) que puede resolver DNA-PAINT para un conjunto determinado de parámetros de imagen. La fracción de moléculas con un NN por debajo de este umbral de distancia (azul, sombreado) se puede calcular para una densidad dada y una resolución de PINTURA de ADN dada. c, mapa 2D de la fracción de moléculas no resolubles en función de la densidad y la resolución. d, los cortes 1D de c a diferentes resoluciones (codificados por colores) se pueden usar como una guía del usuario para estimar la cantidad de rondas de multiplexación necesarias para realizar RESI de manera eficiente dada una determinada fracción objetivo de distancias no resolubles.

Secuencias de cadena corta para origami de ADN 2D con sitios de unión espaciados a subnanómetros, 5 nm y 20 nm y secuencias de cadena corta para origami 3D.

Secuencia de cadena de andamio (M13mp18) para origami de ADN 2D.

Secuencia de cadena de andamio (p7560) para origami de ADN 3D.

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Reinhardt, SCM, Masullo, LA, Baudrexel, I. et al. Microscopía de fluorescencia con resolución de Ångström. Naturaleza 617, 711–716 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

Descargar cita

Recibido: 21 julio 2022

Aceptado: 07 de marzo de 2023

Publicado: 24 mayo 2023

Fecha de emisión: 25 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9

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