Las relaciones entre la diversidad de microbiomas y la epidemiología en especies domésticas de malaria

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9081 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La microbiota del mosquito juega un papel importante en su comportamiento y competencia vectorial. La composición de su microbioma está fuertemente influenciada por el medio ambiente, especialmente por su hábitat. Los perfiles de microbioma de mosquitos Anopheles sinensis hembra adultos de áreas hiperendémicas e hipoendémicas de malaria en la República de Corea se compararon mediante la secuenciación de Illumina 16S rRNA. En diferentes grupos epidemiológicos, los análisis de diversidad alfa y beta fueron significativos. El principal filo bacteriano fue Proteobacteria. Las especies más abundantes en el microbioma de los mosquitos hiperendémicos fueron los géneros Staphylococcus, Erwinia, Serratia y Pantoea. En particular, se identificó un perfil de microbioma distinto caracterizado por el predominio de Pseudomonas synxantha en el área hipoendémica, lo que sugiere una correlación potencial entre los perfiles de microbioma y la incidencia de casos de malaria.

La malaria, que es causada por el parásito protozoario Plasmodium que infecta a mosquitos y humanos, propaga la infección a sus huéspedes mamíferos por la picadura de mosquitos anofelinos infectados con Plasmodium1. Generalmente, actualmente se ofrecen al público vacunas como Mosquirix contra la malaria2. Sin embargo, aún se deben considerar los costos económicos de la vacuna. Posteriormente, la mayoría de los esfuerzos de intervención se centran en el control de las poblaciones de mosquitos, por lo general utilizando pesticidas químicos. El uso abusivo de varios pesticidas químicos resultó en resistencia en las poblaciones de mosquitos3, lo que requirió el uso de estrategias alternativas de control de mosquitos, incluida la manipulación del microbioma del mosquito4,5,6.

El microbioma es un ecosistema de bacterias comensales, simbióticas y patógenas que interactúan con un huésped7. Los mosquitos, como huéspedes naturales, también contienen una amplia gama de microorganismos, incluidas bacterias, hongos y virus8. Entre estos, las bacterias interactúan continuamente con los mosquitos9,10,11 e influyen en la nutrición, el desarrollo, la inmunidad y el comportamiento de los mosquitos huéspedes. Por ejemplo, la infección con el endosimbionte bacteriano Wolbachia pipientis previene numerosas infecciones por arbovirus12,13. De hecho, la introducción de la cepa wMel de Wolbachia pipientis en la población de Aedes aegypti resultó ser eficaz para reducir la incidencia de dengue sintomático y el caso de hospitalizaciones por dengue14. Además, Chromobacterium sp. la exposición causa una alta mortalidad en larvas y adultos de mosquitos y reduce la susceptibilidad de los mosquitos a la infección por malaria y dengue15, lo que sugiere que la microbiota específica en los mosquitos puede alterar la susceptibilidad a la infección por enfermedades16.

Junto con las interacciones fisiológicas, la composición bacteriana de los mosquitos recolectados en hábitats naturales es muy variable según el origen geográfico y la ecología17,18,19,20. Recientemente, los mosquitos Anopheles recolectados en el campo revelan mayores niveles de heterogeneidad entre mosquitos en la composición de la comunidad21. Sin embargo, aún no se ha realizado una investigación exhaustiva de las relaciones entre la incidencia regional de malaria y los perfiles de microbioma. Este estudio presenta un análisis comparativo de los perfiles de microbioma en mosquitos Anopheles sinensis recolectados de áreas endémicas y libres de malaria en la República de Corea (ROK). La malaria por Plasmodium vivax en la República de Corea fue erradicada oficialmente por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 197922. Sin embargo, la malaria resurgió en 1993 en una región en la frontera con Corea del Norte donde se han notificado entre 300 y 500 casos de malaria cada año23. Todavía es difícil de determinar si el resurgimiento de los casos de malaria es el resultado de hábitats naturales específicos y la migración de largo alcance desde el área hiperendémica de malaria de las regiones del norte. La incidencia de la malaria en las regiones fronterizas es más alta que en otras áreas debido a factores como el acceso restringido a la atención médica, la propensión de los grupos marginados, que generalmente viven en las regiones fronterizas, a buscar tratamiento y las dificultades para distribuir iniciativas de prevención en poblaciones de difícil acceso24 . Será difícil erradicar la malaria en las regiones fronterizas, pero mejorar la vigilancia es la clave para encontrar la fuente de cualquier importación o reintroducción nueva. Por lo tanto, los patrones del perfil del microbioma de los mosquitos en varias regiones deben compararse y analizarse para monitorear los brotes de malaria. Por lo tanto, el enfoque de este estudio está en la identificación de la diversidad microbiana en hembras de An. sinensis de áreas libres de malaria o hipoendémicas y áreas hiperendémicas donde se reportaron casos esporádicos de malaria. Mediante el uso de análisis metagenómicos, este estudio profundiza en determinar si An. sinensis en áreas endémicas de malaria poseen perfiles de microbioma distintos.

Un total de 60 hembras adultas An. sinensis se recolectaron mosquitos de 12 áreas diferentes en Corea (5 muestras de mosquitos por área) (Fig. 1). Se diseccionaron el intestino medio y las glándulas salivales de cada mosquito, luego se extrajo el ADN. Se generaron un total de 1.936.902 secuencias a partir de 24 muestras. El número promedio de lecturas de secuencia sin procesar fue de 80 704 (entre 29 566 y 97 799 lecturas).

Sitio de recolección de mosquitos Los sitios de recolección de mosquitos fueron seleccionados en base a la incidencia de casos de malaria. El número de pacientes con paludismo por cada 100.000 se utilizó para dividir las áreas hiperendémicas (HyperE) e hipoendémicas (HypoE). El sitio de recolección se determinó utilizando estadísticas de pacientes con malaria. El análisis podría haber tenido en cuenta incorrectamente el hábitat o la ecología, ya que no se analizó ecológicamente cada región. Las áreas hipoendémicas 1 y 2 se seleccionaron como áreas cercanas al área hiperendémica entre los lugares donde no se presentó la malaria para evaluar el impacto de la epidemiología en lugar de las características geográficas del perfil del microbioma de los mosquitos (HyperE-1: 348-19, Daemari Myojang-ro , Cheorwon-eup, Cheorwon-gun, Gangwon-do HyperE-2: 439-3 Guam-ri, Nam-myeon, Yanggu-gun, Gangwon-do HyperE-3: 31, Dodaero 12beon-gil, Daegwang-ri, Sinseo -myeon, Yeoncheon-gun, Gyeonggi-do HyperE-4: Clase de servicio civil de JSA Daeseong-dong, Josan-ri, Gunnae-myeon, Paju-si, Gyeonggi-do HyperE-5: 119, Tongilchon-gil, Baekyeon-ri , Gunnae-myeon, Paju-si, Gyeonggi-do HyperE-6: 10, Samsanbuk-ro 437beon-gil, Seokmori, Samsan-myeon, Ganghwa-gun, Incheon HyperE-7: 134 Yeonmijeong-gil, Wolgot-ri, Ganghwa -eup, Ganghwa-gun, Incheon HyperE-8: 83-23, Yulsaeng-ro, Daegot-myeon, Gimpo-si, Gyeonggi-do HypoE-1: 564 Cheongna-dong, Seo-gu, Incheon HypoE-2: 283 -2, Sinjeop-ri, Buknae-myeon, Yeoju-si, Gyeonggi-do HypoE-3: Montaña 110, Seonyo-ri, Sangju-si, Gyeongsangbuk-do HypoE-4: 36, Hakdong-gil, Suncheon-si, Jeollanam-do).

Posteriormente se evaluaron las métricas de la diversidad alfa. (Información complementaria 1). Se utilizó diversidad alfa para analizar las comunidades microbianas. Se utilizó el índice de Shannon para medir la diversidad alfa. El índice de diversidad de Shannon más alto fue el hipoendémico 3 del intestino medio (M) (3,27), seguido del hiperendémico 6M (2,32) y el hipoendémico 2 de las glándulas salivales (S) (2,29). La diversidad alfa de todas las muestras evaluadas por la diversidad de Shannon se analizó por órgano y epidemiología (Fig. 2). Hubo diferencias significativas entre las áreas hiperendémicas e hipoendémicas.

Comparaciones de diversidad alfa por pares del microbioma de An. sinensis de diferentes tipos de (A) órgano y (B) epidemiología. Una comparación de la diversidad de Shannon en áreas hiperendémicas e hipoendémicas reveló diferencias significativas (H = 10,53, valor p = 0,001, valor q = 0,001). Para realizar estas comparaciones (valor q) se utilizaron las pruebas de Kruskal-Wallis con corrección Benjamini-Hochberg FDR. El nivel de significancia se fijó en \(\hbox {q}<0.05\), con n = el número de muestras procesadas y cada conjunto contiene 5 mosquitos individuales.

Los perfiles del microbioma de los mosquitos se presentaron a nivel de filo y género para cada región y órgano (Fig. 3). La más dominante fue Proteobacteria (74,52%), seguida de Firmicutes (14,67%), Actinobacteria (5,65%) y Bacteroidetes (2,57%) (Fig. 3A, B, Información complementaria 2). Estos cuatro filos representaron el 96-99% de la UTO total en la mayoría de las muestras (Información complementaria 2). Sin embargo, se encontraron espiroquetas (31,1%) en 8M hiperendémicos con una proporción alta (Información complementaria 2). Se encontraron firmicutes en el área hiperendémica 1M, 1S, el área hiperendémica 3M, 3S y el área hiperendémica 7S (Fig. 3A, Información complementaria 2) con una proporción alta que en otras regiones. Se observó que Bacteroidetes era más prevalente en 1S, 2S y 4S hiperendémicos que en otras regiones (Fig. 3A, Información complementaria 2).

Los datos a nivel de género se analizaron para identificar las unidades taxonómicas operativas (OTU) bacterianas presentes en todas las muestras de mosquitos. (Fig. 3C, D, Información complementaria 3). Se encontraron un total de 51 géneros, los cinco géneros bacterianos más abundantes (abundancia promedio) fueron Pseudomonas (29,22%), Staphylococcus (10,5%), Erwinia (9,37%), Serratia (6,91%) y Acinetobacter (6,7%) (Fig. 3C,D, Información Complementaria 3). Se observaron variaciones en los perfiles de microbioma en diferentes regiones dentro del área hiperendémica. El área hiperendémica 1 más cercana a la frontera norte tenía una mayor proporción de Staphylococcus que las otras regiones (Figs. 1, 3, Información complementaria 3). Brevibacterium se encontró en gran abundancia en el área hiperendémica 1S, sin embargo, este microbioma no se encontró en ninguna otra región excepto en el área hiperendémica 6S. Staphylococcus también se encontró a una tasa más alta que en otras regiones en el área hiperendémica 3, que es la región más cercana al área hiperendémica 1. En el área hiperendémica 3, Erwinia y Enterobacteriaceae_uc dominan el perfil del microbioma. Erwinia también se observó en una alta proporción en las áreas hiperendémicas 4M y 7M. A pesar de ser regiones de rango cercano, las áreas hiperendémicas 4 y 5 mostraron perfiles de microbioma distintos y también hubo diferencias sustanciales entre los órganos. Acinetobacter dominó el microbioma en el área hiperendémica 4S, seguida por Chryseobacterium, Erwinia y Pseudomonas. El perfil del microbioma del área hiperendémica 5M estuvo dominado por Enterobacteriaceae_uc, seguido por Serratia. Acinetobacter dominó el perfil del microbioma en el área hiperendémica 5S, seguida por Arcobacter y Pantoea. En el área hiperendémica 6, el intestino medio y las glándulas salivales tenían un perfil de microbioma dominado por Serratia y Gibbsiella. El perfil del microbioma del área hiperendémica 7 varió según el órgano. Pantoea y Erwinia fueron dominantes en el área hiperendémica 7M, mientras que Staphylococcus y Asaia fueron dominantes en el área hiperendémica 7S. El área hiperendémica 8S mostró un perfil de microbioma distinto dominado por Arcobacter. Las áreas hiperendémicas 8M y 2M tenían un microbioma similar a las áreas hipoendémicas. Pseudomonas dominó el perfil de microbioma de todas las áreas hipoendémicas (Información complementaria 3).

Perfiles de microbioma de mosquitos Anopheles sinensis adultos a nivel de filo y género. Los gráficos de la barra lateral izquierda representan los perfiles de microbioma de mosquitos Anopheles sinensis hembra adultos recolectados en 12 regiones que se dividen en áreas hiperendémicas (A: nivel de phylum, C: nivel de género) e hipoendémicas (B: nivel de phylum, D: nivel de género). Cada barra representa el perfil del microbioma de la muestra agrupada por órgano y región (M: intestino medio, S: glándulas salivales). Los gráficos de la barra lateral derecha representan el promedio de todas las regiones.

A nivel de especie, Pseudomonas synxantha (24,54 %) fue dominante seguida de Serratia ficaria (6,52 %), Acinetobacter soli (6,12 %), Arcobacter butzleri (4,89 %), Staphylococcus aureus (4,46 %), Pantoea agglomerans (3,7 %) y Erwinia persicina (3,4%) (Información complementaria 4). En el área hiperendémica, un perfil de microbioma distinto varió según cada región en el área hiperendémica, similar al nivel de género (Información complementaria 4). La investigación se centró en identificar biomarcadores de especies, que son especies que se encuentran exclusivamente en regiones específicas a nivel de especie (Tabla 1). Las áreas hiperendémicas 1, 3, 4, 6, 7 y 8 mostraron valores significativos. El microbioma específico de la región dominaba en el perfil del microbioma de cada región, como Serratia ficaria, Staphylococcus sciuri, Erwinia persicina, Staphylococcus aureus, Arcobacter butzleri y Erwinia iniecta.

Primero, los valores promedio de los microbiomas del intestino medio y de las glándulas salivales se compararon en todas las regiones (Información complementaria 3). El perfil del microbioma de las glándulas salivales consistió en Pseudomonas (29,32 %), Acinetobacter (12,33 %), Staphylococcus (12,1 %), Arcobacter (9,55 %) y Serratia (5,21 %). El perfil del microbioma del intestino medio consistió en Pseudomonas (29,11 %), Erwinia (14,81 %), Staphylococcus (8,89 %), Serratia (8,61 %) y Pantoea (6,03 %) (Información complementaria 3). Los perfiles de microbioma del intestino medio y las glándulas salivales se evaluaron en función de su presencia o ausencia en las muestras (Fig. 4).

(A) Análisis del diagrama de Venn de géneros compartidos por órgano (B) Perfil de microbioma de las glándulas salivales del intestino medio (C). Hay 21 microbiotas compartidas por el intestino medio y las glándulas salivales, así como 20 y 10 microbiotas específicas de órganos, respectivamente. El microbioma compartido por ambos órganos tuvo una proporción alta, y Arcobacter fue el único microbioma órgano-específico en las glándulas salivales con un porcentaje superior al 5%. En Acinetobacter, hubo una diferencia estadísticamente significativa (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, \(\textit{p}<0.05\)).

En ambos órganos, se encontró que prevalecían los 21 géneros comúnmente encontrados, y el microbioma del intestino medio tenía más taxones específicos de órganos (20 géneros) que las glándulas salivales (10 géneros, Fig. 4A). Aunque se identificaron microbiotas específicas de órganos como Arcobacter, Brevibacterium, Chryseobacterium, Asaia y Enterobacteriaceae, solo Acinetobacter tiene una diferencia estadísticamente significativa (Fig. 4B,C). Luego, se compararon las diferencias por órgano dividiendo las áreas hiperendémicas e hipoendémicas. El microbioma dominante en el intestino medio y la glándula salival fue el mismo en el área hiperendémica 6 (Serratia) y en todas las áreas hipoendémicas (Pseudomonas) (Tabla 2). Sin embargo, el microbioma que dominaba el intestino medio y las glándulas salivales era diferente en las áreas hiperendémicas (2–7) (Tabla 2). Por ejemplo, Staphylococcus y Brevibacterium en el área hiperendémica 1, Pseudomonas y Acinetobacter en el área hiperendémica 2 fueron dominantes en el intestino medio y las glándulas salivales, respectivamente (Tabla 2).

Los datos se compararon además en función de la incidencia de pacientes, lo que permitió una división entre áreas hiperendémicas e hipoendémicas. Hubo una diferencia significativa en los análisis de diversidad alfa y beta según la epidemiología (Tabla 3, Figs. 2, 6). Las áreas hiperendémicas e hipoendémicas fueron significativas en el análisis PERMANOVA utilizando la distancia de Jaccard, que evalúa la disimilitud entre conjuntos de datos (Tabla 3). Además, en ambas áreas, el índice de diversidad de Shannon, que es una medida del número (abundancia) y abundancia relativa (uniformidad) de especies en el ecosistema, fue significativo (Fig. 2).

(A) Análisis del diagrama de Venn de géneros compartidos por epidemiología. (B) Perfil promedio de microbioma de áreas hiperendémicas y (C) hipoendémicas. Los mosquitos en áreas hipoendémicas e hiperendémicas comparten 11 microbiotas, con 23 y 17 microbiotas únicas identificadas en cada una. Se observa Pseudomonas en ambas áreas, que es mucho más prevalente en el área hipoendémica. Staphylococcus tuvo la prevalencia más alta en el área hiperendémica, seguida por Erwinia, Pseudomonas, Serratia, Acinetobacter, Arcobacter y Pantoea. Pseudomonas y Pantoea fueron las microbiotas estadísticamente significativas.

Ambas áreas compartieron 11 microbiotas principalmente Pseudomonas y Acinetobacter. Según el análisis realizado, los mosquitos de áreas hiperendémicas exhibieron 17 taxones únicos, en los que predominaron Staphylococcus (15,56 %), Erwinia (14,05 %), Pseudomonas (10,46 %), Serratia (10,25 %), Acinetobacter (9,48 %) (Fig. 5). En áreas hipoendémicas, Pseudomonas (66,73 %) domina el perfil del microbioma, seguida de Anaerobacillus (4,49 %) (fig. 5B). El perfil del microbioma de las áreas hiperendémicas e hipoendémicas tiene diferencias significativas en Pseudomonas y Pantoea (Fig. 5B,C). Pantoea solo se observó en áreas hiperendémicas (Fig. 5B, C). Pseudomonas se encontró en una proporción baja en el área hiperendémica pero dominaba en el área hipoendémica (Fig. 5B, C).

El análisis principal coordinado (PCoA) mostró una gran variación en las comunidades microbianas según la epidemiología y el sitio de recolección (Fig. 6). En el gráfico, a excepción del área hiperendémica 2-M, que está cerca de la muestra del área hipoendémica en el gráfico, el área hiperendémica y el área hipoendémica mostraron patrones diferentes. Las muestras en el área hipoendémica se agruparon independientemente de la región, pero las muestras en el área hiperendémica tenían un patrón de agrupamiento según la región. En el área hiperendémica se confirmaron 3 agrupamientos (Grupo 1: 1M, 1S, 3M, 3S, 7M, 7S, 8M, 8S, Grupo 2: 5M, 6M, 6S, Grupo 3: 2S, 4M, 4S, 5S) ( Figura 6). El grupo 1 compartió Erwinia, Pseudomonas y Staphylococcus, y el Grupo 2 compartió Methylobacterium, Serratia y Gibbsiella. El grupo 3 compartió Pseudomonas, Acinetobacter, Pantoea y Chryseobacterium (Información complementaria 3).

Gráficos de análisis coordinado principal (PCoA) en 3D de las distancias Bray-Curtis de la diversidad del microbioma de Anopheles sinensis de hembras adultas según la epidemiología y el órgano. Esta figura ofrece imágenes que se tomaron en múltiples rangos de ángulos. El gráfico PCoA es un gráfico en el que se estima la distancia entre áreas en función de su disimilitud en términos de abundancia relativa (Bray-Curtis). Se puede observar que las muestras del área hiperendémica están más dispersas que las del área hipoendémica, mientras que las muestras del área hipoendémica están más juntas.

La definición de microbioma per se se ha ampliado recientemente desde los microorganismos que interactúan con un huésped hasta el total de la microbiota y sus productos genéticos relacionados con el medio ambiente y los huéspedes7 que influyen en la biología, la longevidad, el comportamiento, la nutrición y la inmunidad25,26,27. La microbiota del huésped tiene el potencial de coevolucionar y afectar continuamente la salud del huésped8. Hay varios entornos diferentes donde se puede adquirir la microbiota, incluso a través de la ingesta de alimentos y la invasión de heridas. Como resultado, el hábitat del huésped puede afectar el microbioma del mosquito y puede cambiar según los factores ambientales regionales27. Este estudio tuvo como objetivo investigar si existen diferencias significativas en los perfiles de microbioma de los mosquitos entre las áreas hiperendémicas e hipoendémicas de incidencia de malaria. El objetivo principal de este estudio fue identificar especies de microbios-biomarcadores en diferentes áreas endémicas involucradas en la incidencia de malaria. El estudio actual demuestra que el perfil del microbioma de los mosquitos recolectados en áreas hiperendémicas e hipoendémicas de malaria se dividió en patrones distintos a nivel de género y especie. Los mosquitos en áreas hiperendémicas contenían microbiomas específicos del área, como Serratia, Staphylococcus, Erwinia, Enterobacter y Arcobacter, mientras que Pseudomonas es dominante en áreas hipoendémicas, lo que implica que la incidencia de la malaria se puede analizar con biomarcadores específicos del área. Sorprendentemente, nuestros hallazgos revelaron que la heterogeneidad de los perfiles de microbiomas era mayor en el área hiperendémica en comparación con el área hipoendémica, a pesar de que la distancia espacial entre las áreas hiperendémicas era más cercana que en el área hipoendémica. Se sugiere que la incidencia de malaria en la República de Corea podría estar relacionada con las áreas fronterizas del norte de las zonas calientes de malaria, como Corea del Norte, donde se informaron casos de malaria en más de 5000 pacientes en 201628. Como resultado de la migración humana, las transferencias de población transfronterizas, los cambios ecológicos , y la dinámica de la población de vectores, la malaria fronteriza ocurre con frecuencia en algunas zonas de transmisión29. Los brotes de paludismo en las fronteras entre Tailandia y Myanmar y entre Tailandia y Camboya son brotes fronterizos típicos y están causados ​​por la migración constante de la población, el movimiento de pacientes con paludismo, el abuso de la automedicación y las limitaciones en el control y la vigilancia del vector Anopheles29. En África, los patrones de incidencia de la malaria están generalizados, especialmente en las áreas del desierto subsahariano debido a la migración humana y los cambios geográficos, como la construcción de represas, mientras que la transmisión de la malaria en la República de Corea se limita específicamente a las áreas fronterizas del norte30. Esto sugiere que los mosquitos infectados que migran desde Corea del Norte pueden ser uno de los principales factores de la incidencia de malaria en la República de Corea, considerando la restricción de la migración humana en las áreas fronterizas del norte de la República de Corea. Por lo tanto, es importante rastrear la originalidad de los mosquitos de la malaria y su microbioma en áreas hiperendémicas empleando estudios como métodos de redes aéreas para recolectar mosquitos migratorios a gran altura desde el norte de la DMZ, lo que podría ayudar a erradicar la malaria en ROK31.

El microbioma de las regiones hiperendémicas e hipoendémicas tiene una gran disimilitud (Fig. 6). Sin embargo, este estudio enfrenta ciertas limitaciones para comprender de manera integral la variación regional del microbioma del mosquito dentro del área hiperendémica. Aunque la muestra hiperendémica de 2-M se recolectó de un área hiperendémica, tenía un microbioma similar al encontrado en las muestras recolectadas de un área hipoendémica. Además, las muestras del área hiperendémica mostraron tres agrupamientos, aunque esto no pareció estar fuertemente relacionado con la distancia entre cada región. Se necesitarán más detalles sobre el entorno de la región donde se recolectó el mosquito (como el hábitat acuático del mosquito, las fuentes de sangre, etc.) y si el mosquito está infectado con Plasmodium para comprender la variación por región.

Curiosamente, nuestro estudio demuestra que Pseudomonas es significativamente diferente entre los perfiles de microbioma de mosquitos de áreas hiperendémicas e hipoendémicas, lo que demuestra que Pseudomonas era dominante en áreas hipoendémicas. Pseudomonas se encuentra comúnmente en la microbiota intestinal de los mosquitos Anopheles32,33,34,35, lo que indica que Pseudomonas es capaz de adaptarse de manera eficiente al entorno del intestino medio de los mosquitos Anopheles. Además, un estudio anterior ha señalado que Pseudomonas es la microbiota más prevalente en los grupos negativos a Plasmodium36 y protege a los mosquitos de la invasión de parásitos de la malaria37. Curiosamente, nuestro estudio muestra una baja proporción de la población de Psuedomonas de perfiles de microbioma en las áreas hiperendémicas, lo que indica que podría haber algunos factores, como los parásitos de la malaria, que alteran el equilibrio de la microbiota. Se ha informado que Pseudomonas synxantha inhibe el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis38 que causa la tuberculosis, mientras que se sabe poco sobre el papel de Pseudomonas synxantha en el mosquito. Habiendo dicho eso, será interesante dilucidar la función de Pseudomonas, que es el microbioma más dominante en las áreas hipoendémicas de nuestro estudio. Otro enfoque de nuestro estudio fue la identificación de biomarcadores de especies específicos para diferentes áreas endémicas de incidencia de malaria en la República de Corea. Por lo tanto, es probable que sean importantes más estudios sobre los patrones espacio-temporales del microbioma del mosquito para determinar una variación estacional del microbioma alineada con la incidencia de la malaria, así como para rastrear la migración del mosquito desde otros lugares.

Aunque la función principal del intestino medio y las glándulas salivales de los mosquitos es digerir diversos nutrientes, estos órganos son cruciales para el crecimiento de la microbiota asociada al intestino39,40 y la transmisión de patógenos de enfermedades transmitidas por mosquitos41,42,43,44. La transmisión de los parásitos de la malaria depende del mantenimiento del crecimiento del parásito en el intestino medio y de la culminación de las etapas virulentas de esporozoitos en las glándulas salivales45. Por lo tanto, el microbioma específico de la región como Staphylococcus, Erwinia, Enterobacteriaceae, Serratia, Pantoea y Acinetobacter identificado en cada parte del área hiperendémica de este estudio tiene un papel potencial para interactuar con los parásitos de la malaria. Se sabe que Serratia marcescens bloquea el desarrollo esporogónico de los parásitos P. vivax en An. albimanus46, y las especies de Acinetobacter aumentan la resistencia de An. gambiae al desarrollo de Plasmodium en parte por la inducción de factores anti-Plasmodium en la vía Imd47. Por lo tanto, quedan por investigar los roles potenciales de estas microbiotas específicas de la región en las áreas hiperendémicas sobre el efecto de la transmisión de la malaria. Además de los efectos de la microbiota sobre el desarrollo del parásito, se sabe que la microbiota modula los comportamientos del huésped y, por lo tanto, aumenta la competencia del vector. Se ha informado que la comunicación microbioma-intestino-cerebro-eje puede cambiar la capacidad de percepción sensorial y los comportamientos de succión de sangre de los mosquitos por neuropéptidos específicos secretados por cierta microbiota48. Los mosquitos infectados con parásitos de la malaria muestran comportamientos de succión de sangre más fuertes, lo que aumenta el número de picaduras y la búsqueda precisa de huéspedes humanos49, lo que indica que podría haber algunos cambios en la comunicación microbioma-intestino-cerebro-eje en la comunidad de microbiota modificada. Curiosamente, se ha demostrado que la rápida proliferación de Pseudomonas en el intestino medio del mosquito después de la alimentación con sangre induce la secreción de serotonina para suprimir el apetito, seguida de la secreción de neuropéptido Y (NPY) en el cerebro del mosquito48,50,51, que tiene un papel fundamental en la modulación de la sensibilidad sensorial como el olfato51. Los datos anteriores indican que uno de los neuropéptidos, la taquiquinina, también modula las vías olfativas y las vías de la insulina en insectos52 y los contactos sinápticos entre las terminales de las neuronas taquicinérgicas y las neuronas NPY regulan la actividad neuronal NPY en ratas53, lo que sugiere que los neuropéptidos secretados por el microbioma pueden alterar los comportamientos de búsqueda del huésped. el mosquito por estas vías neuronales. En conjunto, nuestro estudio proporciona evidencia de que la composición del microbioma en el intestino medio y las glándulas salivales muestra patrones espacialmente dinámicos y puede influir en la incidencia de la malaria en la República de Corea. La variación espacio-temporal adicional del microbioma proporcionará pistas más precisas para comprender el origen de los mosquitos de la malaria en áreas hiperendémicas. También será interesante dilucidar los mecanismos moleculares y neuronales de la comunicación microbioma-intestino-cerebro-eje entre el huésped, el microbioma y el parásito que subyacen a la modulación de los comportamientos de búsqueda de huéspedes. Aunque este estudio proporciona una instantánea de los patrones del microbioma en áreas endémicas de malaria en la República de Corea, se requerirán estudios futuros para estimar la concentración de Plasmodium dentro de las muestras de mosquitos para comprender completamente los patrones exactos y la dinámica del microbioma en un mosquito individual, lo que podría explicar la correlación entre las esporas de Plasmodium y la composición del microbioma. Más adelante, la comprensión completa de los patrones del microbioma de los mosquitos de la malaria en la República de Corea y la península de Corea mitigará los esfuerzos del programa de erradicación de la malaria.

Se recolectaron mosquitos Anopheles sinensis adultos hembra en 2020 (del 22 al 26 de junio) en 12 regiones rurales de la República de Corea con la asistencia del centro regional para la vigilancia de vectores contra el cambio climático apoyado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Corea54. Los sitios de recolección se clasificaron como área hiperendémica si el número de casos de malaria por cada 100 000 personas supera a 1 paciente. En caso contrario, se catalogó como zona hipoendémica (fig. 1). Las regiones de estudio se determinaron utilizando estadísticas de pacientes con malaria. El análisis podría haber tenido en cuenta incorrectamente el hábitat o la ecología, ya que no se analizó ecológicamente cada región. Los mosquitos se clasificaron por género utilizando las claves morfológicas55 y las identificaciones de las especies se confirmaron mediante un ensayo de PCR de diagnóstico basado en el análisis de código de barras de ADN56. Las partes del cuerpo del mosquito, como patas y alas, se transfirieron a un tubo de 1,5 ml (Axygen, EE. UU.), después de lo cual se realizó la extracción de ADN de las partes del mosquito utilizando el kit de extracción de ADN total G-spin™ (iNtRON's, Corea) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los parámetros del ciclo de PCR involucraron una desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 63 °C y 2 min a 72 °C. Se completó una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % y se visualizaron bajo luz ultravioleta.

La extracción de ADN se centró en el intestino medio y la glándula salival del mosquito hembra adulto. Antes de la disección, los mosquitos se esterilizaron superficialmente durante 1 min en etanol al 70 % y luego se diseccionaron en PBS (solución salina tamponada con fosfato). El área de trabajo del microscopio estereoscópico de disección también se higienizó con etanol al 70% durante la disección. Se agruparon los intestinos medios y las glándulas salivales (cada muestra constaba de 5 mosquitos) y se mantuvieron a -80 °C. El ADN del genoma completo se extrajo en condiciones asépticas utilizando el kit de suelo Power (Qiagen, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las muestras se utilizaron para el análisis metagenómico de 16S después de comprobar la calidad y la cantidad del ADN. Se crearon dos bibliotecas etiquetadas con ARNr 16S basadas en amplicones.

Para todas las muestras, el Centro Nacional de Instrumentación para la Gestión Ambiental (NICEM, Corea) realizó amplificación por PCR, procesamiento de muestras y secuenciación del gen 16S rRNA (www.nicem.snu.ac.kr). Las muestras se amplificaron utilizando 2 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, Suiza) y cebadores para la región V3-V4 del gen 16S rRNA (Información complementaria 5). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 3 min a 96 °C, luego 30 ciclos de 30 s a 96 °C, 30 s a 55 °C, 30 s a 72 °C y finalmente 5 min a 72 °C. Todos los resultados de la PCR se realizaron luego en geles de agarosa al 1,2 % para determinar el tamaño y la intensidad de la banda. Se utilizaron perlas Ampure XP (Beckman, EE. UU.) para purificar el ADN amplificado de cada muestra. Según el contenido de ADN y el peso molecular, las muestras se agruparon en cantidades idénticas y se utilizaron para crear bibliotecas de ADN de Illumina. Luego, las bibliotecas se secuenciaron en ejecuciones de Illumina MiSeq para obtener lecturas de extremos emparejados de 2 × 300 pb. Las lecturas de secuenciación de extremos emparejados se importaron primero a las canalizaciones QIIME2 v.2021.1157 para obtener "conocimientos cuantitativos de la ecología microbiana", y la v.2021.11 de la canalización se utilizó para procesar y analizar las lecturas de secuenciación. El comando de denoise-paired se usó para corregir errores, eliminar quimeras e integrar lecturas de extremos emparejados usando el complemento DADA2 en QIIME 258. La secuencia generada se utilizó para comparar la composición bacteriana y el análisis de taxonomía más adelante. Además, se utilizó la canalización analítica de chunlab PKSSU 4.0 DB para agrupar secuencias con un nivel de divergencia del 3 % (o 97 % de similitud), las secuencias se eliminaron del ruido y se asignaron a una unidad taxonómica operativa (OTU). Se eliminaron las secuencias quiméricas que no podían vincularse definitivamente a una OTU. Las UTO que no pudieron categorizarse taxonómicamente se etiquetaron como "no clasificadas" y se excluyeron de un análisis posterior. Para nuestro análisis se utilizaron conjuntos de datos a nivel de filo, género y especie. En cada nivel, los datos de conteo y proporción se proporcionan por igual, y los datos de proporción se usaron para el análisis. A modo de comparación, los datos de proporción se subdividieron en epidemiología y órgano (Información complementaria 2–4).

A nivel de phylum, género y especie, se evaluaron los datos de conteo de lecturas y abundancia para las OTU bacterianas. Los taxones de baja abundancia con un valor inferior al 1% se agruparon en una categoría de "Otras bacterias". La base de datos EzBioCloud 16S está diseñada para funcionar mejor en la identificación a nivel de especie, aunque existe una limitación debido a la falta de diferencias de secuencia en algunas especies estrechamente relacionadas. La combinación de EzBioCloud 16S DB y canalizaciones bioinformáticas sensibles nos permite una exploración a nivel de especie de los datos del microbioma.

Se utilizaron biomarcadores de especies para encontrar la microbiota específica de cada sitio de recolección. Todos los análisis se realizaron utilizando "Perfiles taxonómicos de microbioma (MTP) basados ​​en 16S - Analizador comparativo para conjuntos de MTP - Descubrimiento de biomarcadores taxonómicos", utilizando la aplicación EzBioCloud. Se comparó un grupo que contenía muestras de todas las regiones y un grupo que contenía solo muestras de una región específica mediante la prueba Kruskal-Wallis H, y entre la microbiota con valores estadísticamente significativos, las dos o tres microbiotas con la proporción más alta se seleccionaron como biomarcadores de especies. (Información Complementaria 6).

La diversidad de Shannon, Jaccard y el índice de disimilitud de Bray-Curtis se utilizaron para analizar la diversidad microbiana dentro (diversidad alfa) y entre (diversidad beta) muestras en QIIME2. Los índices promedio de Shannon que resultaron se informaron y compararon entre muestras utilizando pruebas de Kruskal-Wallis por pares con correcciones Benjamini-Hochberg FDR para comparaciones múltiples. Los resultados de los índices de disimilitud de Jaccard y Bray-Curtis se compararon entre muestras mediante pruebas PERMANOVA pareadas (999 permutaciones) con correcciones FDR. Los análisis estadísticos descritos anteriormente se realizaron con EZbiocloud59 (https://www.ezbiocloud.net/) y QIIME260.

Las lecturas del metagenoma obtenidas de este estudio se han depositado en NCBI bajo BioProject PRJNA844511. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del documento o se enviarán y estarán disponibles en un repositorio público en NCBI.

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Este trabajo fue apoyado por un fondo de investigación de la Agencia de Prevención y Control de Enfermedades de Corea (KDCA; 6332-304-210 y 6331-311-210). Este trabajo fue apoyado por el Programa de Asistencia a la Investigación (2021) en la Universidad Nacional de Incheon. Agradecemos a 16 Centros Regionales de Vigilancia de Vectores contra el Cambio Climático por recolectar muestras en todo el país, incluidos Soon-Won Lee (Instituto de Salud y Medio Ambiente de GangwonDo), Bo-Young Jeon (Universidad de Yonsei), Tong Soo Kim (Universidad de Inha), Hyung- Wook Kwon (Universidad Nacional de Incheon), Doo-Hyung Lee (Universidad de Gachon), Gil-Hah Kim (Universidad Nacional de Chungbuk), Sung Hoon Jung (Universidad Nacional de Chungnam), Yong Seok Lee (Universidad de Soonchunghyang), Chul Park (Universidad de Salud de Gwangju ), Yeon Soo Han (Universidad Nacional de Chonnam), Hyun Cheol Lim (Instituto de Salud y Medio Ambiente de JeollanamDo), Ohseok Kwon (Universidad Nacional de Kyungpook), Young Ho Kim (Universidad Nacional de Kyungpook), Dong-Kyu Lee (Universidad de Kosin), Kwang Shik Choi (Universidad Nacional de Kyungpook) y Young Min Yun (Universidad Nacional de Jeju).

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Jeong Hyeon Lee, Bilal Mustafa y Hyung Wook Kwon

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Hyun Woo Kim y Hee Il Lee

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JHL, HIL y HWKwon diseñaron el experimento. JHL y BM realizaron experimentos, análisis y obras de arte. HWKim llevó a cabo la recolección de muestras y experimentos de extracción de ADN. JHL, HWKim, BM, HIL y HWKwon escribieron el texto principal del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Hee Il Lee o Hyung Wook Kwon.

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Reimpresiones y permisos

Lee, JH, Kim, HW., Mustafa, B. et al. Las relaciones entre la diversidad de microbiomas y la epidemiología en especies domésticas de mosquitos de Corea mediados por malaria. Informe científico 13, 9081 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35641-3

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Recibido: 06 mayo 2022

Aceptado: 21 de mayo de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35641-3

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